甜叶菊三个UDP-糖基转移酶基因生物信息学分析

孙宇蛟，陈 欣，李 悦，徐慧莹，董 源，王 左，康雨琦

（东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

甜叶菊是一种含糖量很高的作物，叶片中的甜菊醇糖苷（steviol glycosides，SGs）是一种天然的甜味剂，其甜度是蔗糖的300倍左右，但热量只有蔗糖的1/3 000[1]，因此，甜叶菊深受糖尿病、肥胖症等相关疾病患者的关注。近些年来，甜叶菊被大规模运用到食品、医药等相关领域。它作为一种新型的食材和药材，在国内外均广受关注。有研究表明，作为甜菊醇糖苷生物合成途径中的关键酶，尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）通常以甜菊醇为前体，合成不同的甜菊醇糖苷，对甜叶菊甜度和品质的提高有关键作用。

UGT基因种类多样，在许多经济和模式作物中均有研究。Brazier等人通过T-DNA插入手段，获得了拟南芥T3代UGT72B1基因敲除株，发现ugt72b1植株（At4g01070）对3，4-二氯苯胺（3，4-dichloroaniline，DCA）和2，4，5-三氯苯酚（2，4，5-trichlorophenol，TCP）的结合能力显著下降，证明了UGT基因在植物体内的脱毒作用[2]；Jackon等人通过对拟南芥UGT84B1基因过表达植株的研究，发现其具生长激素缺陷的现象，推测该基因可能参与植物激素平衡[3]；Chong等人通过抑制糖基转移酶TOGT基因在烟草中的表达，发现在其植株中出现组织坏死、抗性降低等表型。推测该基因可能与植物防御相关[4]。

在世界范围内，多数学者对甜叶菊糖苷转运代谢、合成及其功能进行了研究，但在基因及蛋白质层面对甜叶菊尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶的研究却不多。本研究依托于生物信息学分析，以甜叶菊3个UGT基因为研究对象，对其蛋白质进行了理化性质分析、初级及高级结构的预测、多序列比对分析，并与康乃馨、陆地棉等其他物种的UGT基因一同构建了分子进化树，以期为甜叶菊作物UGT蛋白质研究及分子辅助育种提供参考及依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

甜叶菊3个尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶基因UGT76G1（AY345974）、UGT85C2（AY345978）、UGT91D1（AY345980）及其他物种UDT基因均来源于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 UGT基因各级结构的分析

采用在线软件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）预测UGT蛋白序列的一级结构，通过ProtScale在线工具（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白质的亲疏水性，利用SOPMA在线软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）预测UGT蛋白序列的二级结构，采用SWISS-MODEL软件（http://www.swissmodel.expasy.org/）预测蛋白质的三级结构。

1.3 多序列比对及分子进化树的构建

通过Clustal X2和DNAMAN进行多序列比对分析，采用MEGA 7.0软件对所有蛋白质编码序列进行分子进化树的构建，采用邻接法（Neighbor-jioning，NJ）建树，其中，校正值（bootstrap）设置为1 000，其他均为默认值。

2 结果与分析

2.1 UGT基因一级结构分析

UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1对应蛋白序列通过https://web.expasy.org/protparam/进行分子量、等电点、氨基酸数量、带正负点的残基总数、分子式、不稳定指数和脂肪酸指数预测，相关结果如表1所示。经分析，从表1中可以看出，等电点集中于6左右，氨基酸数量为520～550个不等，不稳定指数集中于45左右，脂肪族指数为100左右。

表1 UGT基因一级结构分析

2.2 UGT蛋白质的亲疏水性预测

通过https://web.expasy.org/protparam/预测所有蛋白质亲疏水性（GRAVY）。UGT76G1、UGT85C2、UGT91D1对应的GRAVY值分别为－0.089，－0.077，－0.104，这初步说明3个蛋白质呈一定的亲水性；通过http://web.expasy.org/protscale/网站，采用 Hphob./Kyte&Doolittle算法进一步进行亲疏水性预测，图1进一步认证了其均为亲水性蛋白质。

图1 UGT蛋白质亲疏水性预测

2.3 UGT蛋白二级结构预测

利用SOPMA在线软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）预测UGT蛋白序列的二级结构。经过分析，从表2和图2中可以看出，各UGT蛋白含有35%～45%左右的α-螺旋及无规卷曲，含有15%左右的链延伸结构，较少的β-转角。其中，UCT85C2、UCT76G1这2个蛋白除了含有较相近的β-转角外，其余相似度高。

表2 UGT蛋白序列二级结构

图2 UGT蛋白二级结构预测

2.4 UGT蛋白质高级结构预测

通过SWISS-MODEL预测所得序列蛋白质高级结构，3条序列均通过同源建模获得结构预测。从图3中可以看出，3个UGT蛋白结构均有所差异，推测可能是基因在进化过程中内含子插入或丢失造成的。

2.5 多序列比对分析

将甜叶菊中3个UDT基因序列通过Clustal X2及DNAMAN进行多序列比对分析，序列的总体相似度为42.60%.从图4中可以看出，完全一致的序列占较小部分，序列间总体相似度不高，由此推测其在进化过程中存在一定的差异。

2.6 分子进化树的构建

将甜叶菊（Stevia rebaudian）、陆地棉（Gossypium hirsutum）、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、棉豆（Phaseolus lunatus）和烟草（Nicotiana tabacum L.）中已报道的UGT基因通过MEGA 7.0软件进行分子进化树的构建。从图5中可以看出，各分支自展值均大于80，说明建树信息可靠。除此之外，对于同一物种，甜叶菊中的3个UGT基因进化关系比较远；对于不同物种来说，甜叶菊AY345974基因与康乃馨BAD52007基因具有一定的亲缘关系。总体可以看出，不同物种与同一物种间UGT基因均存在一定的进化关系。

图3 UGT蛋白质高级结构预测

图4 甜叶菊3个UGT基因序列比对

图5 分子进化树的构建

3 讨论

本研究通过生物信息学手段对甜叶菊3个UGT蛋白质进行了一级结构亲疏水性分析，二级结构、高级结构的预测，多序列比对和系统进化树的构建。在亲疏水性方面，甜叶菊中UGT蛋白质均为可溶蛋白质，呈较强的亲水性。

向丽等人用5’-RACE和 RT-PCR方法克隆了1条三七UDP-糖基转移酶基因，该基因编码495个氨基酸，蛋白分子量为55 kD，属于不稳定蛋白。其二级结构中α-螺旋占36.16%，β-转角占11.31%，无规卷曲占52.53%，这与本研究中甜叶菊3个UGT基因二级的预测较为相符[5]。除此之外，郭书巧等人在甜叶菊中分离出与本研究同源性很高的UGT76G2基因，研究发现其与玉米、康乃馨、水稻等5种均存在一定的进化关系，但进化地位相差较远，与本研究的进化树结果较为相符[6]。

UGT基因为多拷贝、多家族基因，家族中基因数目比较多，功能不尽相同。近年来，多种UGT基因被渐渐发掘，例如李微微等人在甜叶悬钩子中克隆了18条UDP-糖基转移酶基因，在大肠杆菌中进行了异源表达，并对克隆的基因进行了初步的序列分析，为进一步挖掘和验证甜叶悬钩子中UGT基因功能奠定了基础[7]。随着生命科学和微机科学的迅速发展，生物信息学作为一门独立学科，在发掘新基因、研究生物大分子功能方面发挥着重要作用[8]。本研究依托生物信息学手段，在甜叶菊作物中鉴定3个UDP-糖基转移酶基因，并对其进行蛋白质功能的初步研究，为甜叶菊UGT基因的发掘、提高作物经济效益方面的研究提供了新的思路。

［1］Brandle，J.E.，P.G.Telmer.Steviol glycoside biosynthesis［J］.Phytochemistry，2007，38（42）：1855.

［2］Brazier-Hicks，M.，R.Edwards.Functional importance of the family 1 glucosyltransferase UGT72B1 in the metabolism of xenobiotics in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Journal，2005，42（4）：556-566.

［3］RG Jackson，M Kowalczyk，Y Li，et al.Over-expression of an Arabidopsis gene encoding a glucosyltransferase of indole-3-acetic acid: phenotypic characterisation of transgenic lines［J］.Plant Journal，2002，32（4）：573-583.

［4］J Chong，R Baltz，C Schmitt，et al.Downregulation of a pathogen-responsive tobacco UDP-Glc：phenylpropanoid glucosyltransferase reduces scopoletin glucoside accumulation，enhances oxidative stress，and weakens virus resistance［J］.Plant Cell，2002，14（5）：1093-1107.

［5］向丽，郭溆，牛云云，等.三七PnUGT1基因的全长cDNA克隆和生物信息学分析［J］.药学学报，2012，47（08）：1085-1091.

［6］郭书巧，杨郁文，倪万潮.甜叶菊葡糖基转移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息学分析［J］.基因组学与应用生物学，2009，28（03）：422-428.

［7］李微微，孙雨伟，杨靖亚，等.甜叶悬钩子（Rubus suavissimus S.Lee）中UDP-糖基转移酶基因的克隆、表达及序列分析［J］.工业微生物，2017，47（04）：1-10.

［8］齐安智.计算机算法在生物信息学中的应用研究［J］.中国新通信，2018，20（02）：171.