蓝舌病1型病毒灭活疫苗绵羊免疫试验

廖德芳，苗海生，李 乐，寇美玲，高 林，李华春

（云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

蓝舌病（Bluetongue，BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的，主要感染绵羊、牛和其他家养及野生反刍动物的一种非接触性虫媒病毒病。BTV广泛分布于热带、亚热带地区，至少有27种血清型，且型间无交叉保护。世界动物卫生组织（OIE）将BT列为须通报动物疫病[1-4]。在欧洲，BT已成为继口蹄疫后最受关注的重要动物疫病之一。2005年至今，BT在欧洲及南亚地区大规模流行，疫情范围波及比利时、荷兰、德国、法国、卢森堡、英国、葡萄牙、希腊、奥地利和印度[5-6]，给这些国家带来巨大经济损失。我国于1979年首次报道了BT疫情。2008年流行病学调查发现，我国31个省份存在BTV血清抗体阳性家畜，云南、湖北、重庆、山西、新疆、内蒙古、广西等地在自然感染羊中分离到了BTV[7]。

疫苗免疫接种是预防和控制BT的重要手段。BTV弱毒疫苗是最早使用的疫苗，但由于在减弱制备过程中存在毒力返强风险，目前除南非外，其它地区已不再使用[8]。灭活疫苗是目前预防和控制BT的主要手段。2008年前后，欧洲国家在大范围暴发BT疫情时，广泛使用了灭活疫苗，使疫情得到了有效控制[9]。由于BTV有多个血清型，且型间不能交叉保护，本研究选择致病性强的BTV-1型V863毒株制备灭活抗原，开展灭活疫苗免疫试验和攻毒保护试验，以评价疫苗免疫效果。

1 材料与方法

1.1 疫苗毒株复壮与扩增

疫苗毒株采用BTV-1型V863毒株，由云南省畜牧兽医科学院保存。将毒株用单层生长至90%并且状态良好的BHK-21细胞进行复壮，用PBS清洗细胞1次，然后接种病毒，培养72～96 h；与对照相比，病变达80%时即可收获；病毒滴度达到106TCID50/mL以上时，进行大量扩增。

1.2 病毒灭活、定量及疫苗制备

1.2.1 病毒灭活 每1 000 mL病毒悬液中加入

0.1 mol/L的BEI灭活剂3 mL，置37 ℃搅拌灭活；灭活20 h后换瓶，30 h后加入3 mL 1 mol/L的硫代硫酸钠终止反应，置4 ℃保存；取10 mL灭活病毒液，加入到长满BHK-21细胞的800 mL培养方瓶内，另加入50 mL培养液，置37 ℃温箱，每日观察至第5日；对未发生病变的细胞，反复冻融3次后继续传代观察，如第3代仍未出现病变，则视为灭活彻底。

1.2.2 抗原定量 采用蔗糖密度梯度离心法纯化BTV毒株，获得标准抗原；利用BCA蛋白定量方法定量标准抗原。倍比稀释标准抗原后，利用ACELISA同时检测标准抗原和病毒灭活液，获得标准抗原含量变化曲线；将病毒灭活液与该曲线对比，获得病毒灭活液抗原含量。

1.2.3 抗原浓缩及乳化 每1 000 mL病毒液内加入70 g PEG6000和22.2 g氯化钠，4 ℃搅拌过夜，充分溶解；置Backman J2-M1转头离心瓶内，4 000 r/min离心60 min；每1 000 mL抗原液用10 mL MEM维持液重悬沉淀；将浓缩抗原，用MEM维持液分别稀释为1、5、10、50和100 μg抗原含量；对1、5、10、50、100 μg/mL抗原含量的病毒液分别进行乳化，最后加入2 mL Tween-80及1 mL 1%的硫柳汞，完成100 mL疫苗制备。

1.3 动物免疫、攻毒和样品采集

1.3.1 试验动物及分组 36只成年考摩型绵羊购自云南省种羊场。利用BTV cELISA方法、微量细胞中和试验确定试验羊为BTV抗体阴性羊。随机分为6组，每组6只。其中：1组为空白对照组，免疫乳化后的BHK-21细胞液；其他5个试验组分别免疫抗原含量为 1、5、10、50、100 μg/只份的疫苗。

1.3.2 免疫及样品采集 疫苗免疫：待试验绵羊适应新饲养环境后，采用皮下注射，进行第1次免疫。试验组每只免疫2 mL疫苗，空白对照组免疫乳化后的BHK-21细胞液。首次免疫后第3周进行第2次免疫，方法及用量同上。样品采集：疫苗免疫0、1、2、3、4、5周后，分别用普通采血管和肝素钠抗凝采血管，各采集血样5～8 mL。

1.3.3 攻毒试验及样品采集 首次免疫后5周，用同型BTV攻毒，每只绵羊皮下接种血毒1 mL。采用滴度为104.25CEID50的BTV-1肝素抗凝血（云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室保存）攻毒，并分别于0、2、4、6、8、10、12、14 d采集EDTA抗凝血，进行qRT-PCR检测。

1.4 微量血清中和试验

微量细胞中和试验方法，按世界动物卫生组织（OIE）标准操作指南进行。首先将血清于56 ℃水浴灭活30 min；在微量细胞培养板各孔内，加入50 μL维持液，第1排再加25 μL维持液；将待检血清加入第1排孔中，每孔25 μL，即第1排孔血清为1/4倍稀释；混匀后，用移液器从第1排孔内吸取50 μL移入第2排孔混匀，则第2排孔内血清为1/8稀释，依次稀释，则第8排孔内血清为1/512倍稀释。将病毒稀释成100 TCID50（50 μL），每孔加 50 μL 病毒稀释液，并 设 立 100 TCID50、10 TCID50、1 TCID50的病毒和空白对照。将细胞培养板放入37 ℃ 5%CO2养箱中反应1 h；最后每孔加100 μL BKH-21细胞悬液，置37 ℃ CO2培养箱中（CO2浓度为5%）培养48 h。当对照成立时，进行试验结果判定：被检血清孔出现100%的细胞病变（CPE）时，判为阴性；50%以上出现保护，则为阳性。用Karber法计算血清中和抗体滴度。

1.5 qRT-PCR检测

qRT-PCR检测在ABI FAST 7500上进行。采用一步法RT-PCR TAKARA RR064A试剂盒（大连宝生物），按照试剂盒说明书配制反应液。采用20 μL体系，每个反应加模版2 μL、引物0.4 μL、探针0.4 μL。反应条件为：42 ℃反转录5 min，95 ℃反应10 s，45个循环扩增反应包括95 ℃ 5 s，60 ℃延伸34 s。引物和探针按SWISS ASSAY方法进行[10]。引物和探针如下：

BTVF-MH：5'-TGGAAAAGCGATGTCAAA-3'

BTVR-MH：5'-ACATCATCACGAAACGCTTC-3'

BTVP-MH：

5'- FAM-ARGCTGCATTCGCATCGTACGC-BHQ1-3'

2 结果

2.1 抗原定量

经抗原定量检测，确定本批次抗原浓度为6.25 μg/mL。应用PEG 6000浓缩后，分别制备1、5、10、50、100 μg/只份的5组灭活疫苗。

2.2 微量血清中和试验

应用微量血清中和试验，对免疫后绵羊血清进行BTV-1型中和抗体滴度检测。检测结果显示（表1）：第1组（1 μg/只份）首次免疫后阳性率为33.3%，第2次免疫后阳性率为66.7%；第2组（5 μg/只份）首次免疫后阳性率为66.7%，第2次免疫后阳性率为100%；第3组（10 μg/只份）首次免疫后阳性率为83.3%，第2次免疫后阳性率为83.3%；第4组（50 μg/只份）首次免疫后阳性率为66.7%，第2次免疫后阳性率为66.7%；第5组（100 μg/只份）首次免疫后阳性率为33.3%，第2次免疫后阳性率为50.0%。其中，最高抗体滴度是第5组的13152号绵羊，抗体滴度达362。

2.3 qRT-PCR 检测

攻毒后第1～5免疫组的核酸阴性率分别为66.7%、83.3%、83.3%、50.0%、66.7%，总核酸阴性率为70.0%，对照组核酸阴性率为0。其中，5、10 μg/只份组的BTV核酸阴性率均为83.3%，保护效果最好（表2）。

2.4 中和抗体滴度与攻毒后病毒检出率比较

以第5周攻毒时的中和抗体滴度为基准进行对比。结果显示：免疫绵羊中，当中和抗体滴度＜11时，攻毒后病毒阳性率为62.5%；当中和抗体滴度≥64时，攻毒后病毒阳性率为0，即实现了完全保护；介于二者之间时，病毒阳性率为20.0%～25.0%（表3）。

表1 BTV中和抗体滴度检测结果

表3 中和抗体滴度与攻毒后病毒检出率比较

表2 疫苗免疫试验攻毒后qRT-PCR检测结果

3 讨论与结论

目前国际上预防和控制BT的主要手段是对易感动物接种BTV灭活疫苗。我国目前对该病的重视程度远远不够，相关预防技术储备缺失，一旦疫情暴发，将难以控制。

本研究采用BTV-1型 V863毒株制备的BTV-1型灭活油佐剂疫苗，能够刺激绵羊机体产生BTV-1型中和抗体；应用微量血清中和试验，对免疫后绵羊血清进行中和抗体检测，发现接种1、5、10、50、100 μg/只份 BT灭活疫苗的绵羊，经2次免疫后抗体阳性率分别为66.7%、100%、83.3%、66.7%、50.0%。其中，5 μg/只份组的BTV-1型中和抗体均呈阳性（滴度≥11判为阳性），100 μg/只份组内最高血清中和抗体滴度高达362，免疫效果理想，达到应用要求。由于国内流行的BTV毒株一般不会导致动物出现显著临床症状，因此在攻毒试验环节，除通过观察绵羊是否出现临床症状外，主要依据BTV在绵羊血液中能否扩增来衡量疫苗保护效果[10]。中和抗体滴度与攻毒后病毒检出率比较结果表明，只有中和抗体滴度≥64时，才可实现完全保护，因此在生产实践中要保证免疫动物处于较高的免疫保护水平。qRT-PCR检测结果表明，第1～5组绵羊攻毒后的病毒阴性率分别为66.7%、83.3%、83.3%、50.0%、66.7%，即相应比率绵羊获得了保护，其中5 μg/只份组和10 μg/只份组BTV核酸阴性率均为83.3%，保护效果较好。

本试验使用绵羊数量偏少，绵羊个体差异可能会影响疫苗免疫效果，造成高抗原含量疫苗组反而比低抗原含量疫苗组免疫效果差，但不影响10 μg/只份的BTV灭活抗原含量可作为BTV灭活疫苗生产的推荐用量，这在BTV疫苗生产中具有一定的指导意义。同时试验表明，BTV中和抗体滴度≥64时可以实现完全保护，可以此作为今后高效BTV灭活疫苗研究的依据。

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