浙江省一规模猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定

周 蕾，虞一聪，董建斐，柴 娟，王雅婷，刘爱军，谢荣辉，倪柏锋，张传亮，赵灵燕，桂平雄

（浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州 310018）

副猪嗜血杆菌（Haemofhilus parasuis，Hps）是巴氏杆菌科嗜血杆菌属的，体积较小、不运动、多形性（从单球杆菌到丝状链）革兰氏阴性菌，在巧克力琼脂平板培养1～3 d后，产生小的、棕色至灰白色菌落，在血平板上（含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），产生小的、半透明、不溶血菌落[1]，是定殖于仔猪上呼吸道的一种常在菌。仔猪出生后可通过分娩时与母猪接触而感染Hps。家猪和野猪是该菌当前已知的仅有宿主[1-2]。早在1910年，德国科学家Glässer在患有纤维素性浆膜炎的病猪渗出液中发现了该菌。1969年，Biberstein和White证实该菌在生长时不需要X因子（氯化高铁血红素），并将其命名为副猪嗜血杆菌[1]。2017年12月，浙江省杭州市萧山区一规模猪场保育舍猪群出现高热（41.5 ℃）、咳嗽、腹式呼吸、关节肿胀伴有跛行和被毛粗乱等临床症状，为明确病原，对2头死病猪的肺脏进行了细菌分离鉴定。

1 材料

1.1 设备

LH11 CO2培养箱：购自Thermo scienti fi c公司；Scope A1显微镜：购自ZEISS公司；1300 Series A2生物安全柜：购自Thermo scienti fi c公司；Research plus移液器：购自Eppendorf公司；Thermo Mixer C恒温混匀仪：购自Eppendorf公司；5424离心机：购自Eppendorf公司；Speed Cycler2 PCR仪：购自Analytik jena公司。

1.2 培养基和试剂

血琼脂平板、巧克力平板：购自郑州安图生物工程股份有限公司；革兰氏染色液试剂盒：购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌、副猪嗜血杆菌标准菌株：购自中国兽医药品监察所；氧化酶试剂：购自杭州怡丹生物技术有限公司；Ex Taq酶：购自TaKaRa；QIAamp®DNA纯化试剂盒-Mini：购自QIAGEN；引物和探针：由上海生工公司合成。

1.3 样本来源

2017年12月21日，对浙江省杭州市萧山区某规模猪场2头40日龄病死保育猪进行剖检，无菌采集2份肺脏病变样品（编号为肺1、肺2）做细菌分离培养。

2 方法

2.1 细菌分离和纯化

2.1.1 细菌分离 无菌操作，切开肺脏病变组织，用接种环刮取病料接种于血平板，再用金黄色葡萄球菌作交叉划线，37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h。

2.1.2 细菌纯化 挑取单个可疑菌落接种于巧克力平板，37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h。

2.2 细菌鉴定

2.2.1 菌落形态 于血平板上培养18～24 h，观察菌落形态。

2.2.2 细菌形态及染色特性 挑取可疑菌落进行革兰氏染色，油镜下观察细菌形态及染色情况。

2.2.3 V因子需要测定 将可疑菌株纯培养物接种于血平板（方法同2.2.1）。

2.2.4 过氧化氢酶试验 在洁净的载玻片上滴1滴3%的H2O2溶液，用接种环挑取适量的可疑菌与H2O2溶液混匀，观察是否有气泡产生。

2.2.5 氧化酶试验 用灭菌滤纸条刮取待检细菌纯培养物，并在上面滴1滴氧化酶试剂，10～30 s内观察结果。

2.2.6 PCR检测 根据逯忠新等[3]的方法，合成特异性引物。F1：TAT CGG GAG ATG AAA GAC；F2：GTA ATG TCT AAG GAC TAG；Revx：GAC GAA GCC GCG AGG。 用 DNA 纯化试剂盒，提取待检Hps可疑菌株和标准菌株核酸，分别作为PCR模板和阳性对照。扩增体系为：Taq 酶 0.12 μL，dNTPs 2 μL，F1、F2 引物各0.2 μL，Revx 引物 0.4 μL，10×buffer 2 μL，ddH2O 10.08 μL，DNA模板5 μL。按照以下程序进行扩增：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 1 min，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

3 结果

3.1 细菌分离

在肺2样品中分离到Hps可疑菌株，编号为ZJYK-01235。

3.2 细菌形态学检查

3.2.1 菌落形态 培养24 h后，血平板上呈现半透明、不溶血小菌落，直径为0.5～1 mm。靠近金黄色葡萄球菌菌苔的菌落较大，随着与葡萄球菌生长线距离的增加而变小或不生长，呈“卫星现象”（图1）。

图1 初分离情况

3.2.2 细菌形态 涂片、革兰氏染色后镜检，发现为革兰氏阴性、短小杆菌，呈多形态，从球杆状到丝状链（图2）。

图2 ZJYK-01235菌株显微镜下形态

3.3 V因子需要测定

可疑菌株（ZJYK-01235）在血平板上生长有“卫星现象”（图1），表明该菌株需要V因子。

3.4 过氧化氢酶、氧化酶试验

ZJYK-01235菌株过氧化氢酶试验结果阳性，氧化酶试验阴性。

3.5 PCR检测

对ZJYK-01235菌株进行PCR检测，发现一条1 090 bp大小条带，表明该菌株为Hps（图3）。

图3 ZJYK-01235菌株PCR检测结果

3.6 结果判定

综合分析ZJYK-01235菌株的菌落形态、生长特性、细菌形态学检查情况和PCR检测结果，可以判定该菌株为Hps。

4 讨论

Hps可导致原发性或继发性呼吸道疾病，但在免疫抑制情况下能够侵入机体，扩散到机体其他部分，因而可从全身各部位分离获得[1]。浙江省流行的Hps血清型主要为5/12型、4型、13型和14型，部分猪场还存在2种血清型共感染现象[4]。健康状态下，仔猪在受母源抗体保护时可出现Hps定居，而且在定居菌与仔猪免疫之间达成平衡。当室内温度不稳定、通风不良、早期断奶，以及存在其他病原体感染或猪群中引进了Hps毒力菌株或新毒力菌株时，这种平衡便被打破，从而引起本病发生。Hps可影响2周龄到4月龄的猪，主要导致断奶后和保育阶段的猪发病，通常见于5～8周龄仔猪，发病率一般在10%～15%之间，严重时死亡率可达50%，主要临床表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱，主要剖检病变为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等[5]。

Hps在生长过程中需要V因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD），可在巧克力琼脂平板和含NAD的TSA平板上生长。该菌虽然在普通血平板上不能生长，但如果将其接种在能够提供V因子来源的葡萄球菌划线血平板上进行培养，在靠近葡萄球菌菌苔附近能够生长，并呈现特征性的“卫星现象”。在临床病料初分离时，可以利用这一特点，挑取可疑菌落作进一步纯化和鉴定，这有助于提高该菌的分离率。在Hps初分离时，初学者不宜直接使用巧克力平板和TSA平板。因为在这两种培养基上，Hps菌落特征并不明显，很难与其他杂菌菌落区分开。在Hps纯化培养时，可选用巧克力平板或TSA平板。

在Hps鉴定时要重视形态学检查，并做初步的生化试验，对符合Hps特点的可疑菌株进一步做PCR检测，然后综合形态学、生化特性和PCR检测结果，对分离菌株作出最终鉴定结果。

值得注意的是，Hps也是猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的病原体之一。采用抗生素防治是控制保育阶段Hps、猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌等细菌继发/混合感染的有效手段，是减少猪群死淘率的重要措施。

5 结论

本研究剖检2头具有Hps感染症状病死猪，可见纤维素性肺炎和心包积液；将肺脏病料接种于血平板，并用金黄色葡萄球菌作交叉划线，于37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h，其中一份病料分离到呈“卫星现象”生长的Hps可疑菌落。挑取可疑菌落纯化培养镜检，发现其为革兰氏阴性短小杆菌，呈多形态。氧化酶试验结果为阴性，过氧化氢酶试验为阳性。提取该菌株DNA进行PCR检测，发现一条1 090 bp条带。综合病猪临床症状、剖检变化和分离菌株的形态学检查、生化试验及PCR检测结果，证明该分离株为Hps。

[1] ZIMMERMAN J J，KARRIKER L A，RAMIREZ A，et al.猪病学[M]. 10版. 赵德明，张仲秋，周向梅，等主译.北京：中国农业大学出版社，2014：795-803.

[2] 蒋增海，徐耀辉，邓同炜，等. 副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验[J]，动物医学进展，2016，37（6）：124-128.

[3] 逯忠新，贺英，储岳峰，等. 副猪嗜血杆菌PCR检测方法：NY/T2417-2013[S]. 北京：农业部，2014.

[4] 江军，姜平，王一成，等. 浙江省副猪嗜血杆菌血清型调查及其潜在毒力相关基因分析[J]. 畜牧与兽医，2016，48（8）：1-7.

[5] 蔡旭旺，刘正飞，陈焕春，等. 副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定[J]. 华中农业大学学报，2005，24（1）：55-58.