九香虫提取物的抗疲劳和补肾壮阳活性评价

李 娟，张一唱，崔光红，马晓晶，陈科力，黄璐琦,*

(1中国中医科学院 博士后科研流动站 北京 100700 ；2中国中医科学院 中药资源中心 北京 100700；3湖北中医药大学 武汉430065)

九香虫为半翅目蝽科九香虫亚科昆虫九香虫Aspongopuschinensis的干燥体，别名黑兜虫、瓜黑蝽、臭屁虫、屁巴虫等，为中国特有种.《中国药典》(2015年版)记载九香虫具有理气止痛，温中助阳的功效，用于胃寒胀痛，肝胃气痛，肾虚阳痿，腰膝酸痛.它始载于《本草纲目》：“咸温无毒，用于膈脘滞气，脾肾亏损，壮元阳”.《本草新编》中记载：“虫中之至佳者，亦兴阳之物，以扶衰弱最宜”. 九香虫的壮阳功效虽屡有记载[1,2]，但未见其壮阳功效的实验报道.为此，本文结合壮阳行为与机体疲劳密切的相关性，拟评价九香虫提取物的抗疲劳和补肾壮阳作用.

1 实验材料

1.1 试剂和仪器

氢化可的松(成都艾科达化学试剂, 纯度98%，批号201608122)，大株红景天胶囊(江苏康缘药业，批号150314)，金匮肾气丸(北京同仁堂，批号15032476)，补佳乐(戊酸雌二醇，拜耳医药，批号283A)，生理盐水(武汉滨湖双鹤药业，批号1603300901)，乳酸测试盒(南京建成，批号20160603)，尿素氮试剂盒(南京建成，批号20160923)，超纯水(Water purifier实验室专用超纯水机).

电子分析天平(XB220A，瑞士Precisa)，冷冻离心机(Centrifuge 5804 R，德国Eppendorf)，酶标仪(Synergy 2，美国Bio-Tek).

1.2 实验动物

昆明种小鼠，6～8周龄，体重18～22 g，购自湖北省实验动物研究中心， SPF级，行政许可证编号：SYXK(鄂)2012-0068，生产许可证编号：SCXK(鄂)2015-0018，合格证编号：42000400004612，实验动物从业人员上岗证号：W20150346，W20170310.实验前适应性喂养5 d.

1.3 药材样品

昆虫九香虫购自河北安国药材市场，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定为正品.将九香虫打成粗粉，取6倍量石油醚回流提取2次，每次30 min，倾去石油醚，药渣用8倍量水回流提取2次，合并滤液，浓缩至2 g·mL-1备用.

2 实验方法

2.1 血乳酸测定

参照卫生部《保健食品功能学评价程序和检验方法》(2003 年版)中《抗疲劳作用检验方法》进行.昆明种雄性小鼠，随机分为4组，每组10只，分别为九香虫提取物低剂量组(1.4 g·kg-1，按原药材计)、高剂量组(7.0 g·kg-1)、阳性药组(大株红景天胶囊，590 mg·kg-1)、空白对照组(生理盐水).给药时间为15 d，末次给药30 min后采血20 μL，不负重在30 ℃的水中游泳10 min后和休息20 min后各采血20 μL.用毛细管从眼眶内眦采血，上述3个时间点各采血20 μL，EDTA抗凝，离心取上清液，按照乳酸测定试剂盒检测乳酸含量.血乳酸曲线下面积计算方法：血乳酸曲线下面积= 5× (游泳前血乳酸值+3×游泳后0 min的血乳酸值+2×游泳后休息20 min的血乳酸值)

2.2 负重游泳实验

剂量分组和给药时间同2.1(血乳酸测定).末次给药30 min后，按小鼠体重5%负重铁丝，将其放入水温(25±1) ℃的水槽中使其游泳，开始计时，直至小鼠沉入水底8 s不再浮起，为力竭游泳结束，记录游泳时间.

2.3 血清尿素测定

剂量分组及给药时间同2.1.末次给药30 min后，在30 ℃的水中不负重游泳90 min，休息60 min后采血.采血约0.5 mL置4℃冰箱约3 h，血凝固后离心取血清，用尿素检测试剂盒检测尿素含量[3].

2.4 对肾阳虚小鼠交配能力的影响

雄性小鼠随机分为5组：正常对照组，模型组，阳性对照组(金匮肾气丸，1.4 g·kg-1)，九香虫提取物低、高剂量组(1.4,7.0 g·kg-1).正常对照组和模型组灌胃生理盐水20 mL·kg-1，其余各组分别灌胃相应药物20 mL·kg-1，每日1次，连续30 d，从给药第4 d开始，除正常对照组皮下注射生理盐水5 mL·kg-1外，其余各组均注射氢化可的松25 mg·kg-1，每日1次，连续7 d，造模同时连续给药.雌性小鼠于交配前48 h和3 d按照20 mL·kg-1灌胃补佳乐混悬液(戊酸雌二醇，0.4 mg·kg-1)，使之发情时间同步于交配时间.给药后第30 d给药30 min后观察30 min内交配能力实验(捕捉潜伏期、捕捉率、交配潜伏期、交配率等).脱颈椎处死小鼠，迅速分离胸腺、脾、肾上腺、睾丸、附睾，剖取精囊腺、包皮腺称湿重，计算脏器系数[4-6].

2.5 统计学处理

3 实验结果

3.1 血乳酸测定

九香虫提取物对小鼠乳酸含量的影响结果见表1.由表1可知：九香虫提取物低、高剂量组游泳前、游泳后10 min、休息后20 min血乳酸含量均稍低于空白对照组，各剂量组小鼠游泳前后3个时间点的血乳酸曲线下面积均下降，其中九香虫提取物高剂量组与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05).

表1 九香虫提取物对小鼠乳酸含量的影响 Tab.1 Effect of extract from Aspongopus chinensis on lactic acid content of mice

注：与空白对照组比较，*P<0.05

3.2 负重游泳实验

九香虫提取物对小鼠力竭游泳时间的影响结果见图1.由图1可知：阳性对照组、九香虫提取物低、高剂量组的力竭游泳时间明显高于空白对照组，均具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；九香虫提取物高剂量组对小鼠力竭游泳时间的影响最为显著(P<0.01).

与空白组比较，*P<0.05，** P<0.01图1 九香虫提取物对小鼠力竭游泳时间的影响Fig.1 Effect of extract from Aspongopus chinensis on the loaded swimming time of mice

3.3 血清尿素含量测定

九香虫提取物对小鼠尿素含量的影响结果见图2.

与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01图2 九香虫提取物对小鼠尿素含量的影响Fig.2 Effect of extract from Aspongopus chinensis on the urea content of mice

由图2可知：阳性对照组、九香虫提取物低、高剂量组的尿素含量均明显低于空白对照组，具有显著性差异(P<0.05或P<0.01).

3.4 对肾阳虚小鼠交配能力的影响

3.4.1 脏器系数

九香虫提取物对小鼠脏器系数的影响结果见表2和表3.

表2 九香虫提取物对小鼠胸腺、脾脏和肾上腺脏器系数的影响Tab.2 Effect of extract from Aspongopus chinensis on mice organ coefficient of thymus, spleen, and adrenal gland

注：与正常组比较,△P<0.05，△△P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05

表3 九香虫提取物对小鼠性腺脏器系数的影响

注：与正常组比较,△P<0.05，△△P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表2，3可知：模型组注射氢化可的松造成小鼠肾上腺、胸腺、脾脏、睾丸和附性器官(精囊腺和包皮腺除附睾)等重量较正常组显著降低(P<0.05)，说明肾阳虚造模成功.灌胃给药九香虫提取物30 d后，相对于模型组而言，九香虫提取物高、低剂量组均可不同程度相对增加小鼠免疫器官、睾丸和附性器官的重量(P<0.05或P<0.01).

3.4.2 交配能力

九香虫提取物对小鼠交配能力的影响结果见表4.由表4可知：注射氢化可的松造成小鼠肾阳虚模型，模型组交配潜伏期和交配次数较正常组均有显著性差异(P<0.05)，说明造模成功.相对于模型组而言，给药后九香虫提取物高剂量组小鼠的扑捉潜伏期和扑捉次数(以30 min计)、交配潜伏期和交配次数均有显著性差异(P<0.05或P<0.01).由扑捉率和交配率可见，九香虫提取物高剂量组能明显提高扑捉和交配百分数，而低剂量组对小鼠交配能力的影响不显著.

表4 九香虫提取物对小鼠交配能力的影响

注：与正常组比较,△P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

九香虫含有脂肪、蛋白质、氨基酸、维生素、尿嘧啶、黄嘌呤、以及多种微量元素等[2]，臭气类成分主要为醛酮类，十三烷等低极性成分[7,8].程永现教授从九香虫中发现了结构新颖的多巴胺三聚体(±)-Aspongamide A，该化合物可防治慢性肾病[9]；虫类药物中微量元素锌、锰、钙等可为中药补肾的物质基础.

本文结合中药传统水煎煮的用药方法，先用石油醚除去九香虫中极性较低的油脂类成分，再用水提取得到九香虫水提取物.实验结果表明：九香虫提取物高剂量组能显著降低血清乳酸含量，延长力竭游泳时间，降低血清尿素含量，具有明显的抗疲劳作用，某种程度上较阳性药金匮肾气丸效果更佳；高剂量组还能显著增加氢化可的松导致的肾阳虚小鼠的免疫器官、睾丸和附性器官的脏器系数，提高交配能力，具有明显的补肾壮阳作用，并且功效相对强于金匮肾气丸.同时，九香虫提取物低剂量组也有一定的抗疲劳作用.以上结果说明：九香虫水提取具有显著的抗疲劳和补肾壮阳作用，并呈现一定剂量相关性，本研究为九香虫的药用和功能食品开发提供了研究基础.

参 考 文 献

[1] 郭玉红，张庆林. 药食昆虫九香虫的生物学及开发利用研究进展[J]. 时珍国医国药，2015，26(3)：692-693.

[2] 宋政伟，尹卫平，刘 普，等. 常见蝽类昆虫的化学成分及药理活性研究进展[J]. 应用昆虫学报, 2011，48(3):753-756.

[3] 林新丽，方祝元，朱萱萱，等.复方一把针颗粒对原发性高血压大鼠早期肾损伤的影响[J].医药导报，2016，35(2)：125-129.

[4] 中华人民共和国卫生部药政管理局. 中药新药研究指南(药学 药理学 毒理学)[M]. 北京：中华人民共和国卫生部药政管理局,1994:85-86.

[5] 唐爱存，陈兆霓，梁 韬，等. 葫芦茶乙醇提取物对肝损伤小鼠的保护作用[J].医药导报，2016，35(3)：242-245.

[6] 冯新玲，陈科力，李 娟.龙蔓藤茶增强免疫力功能的实验研究[J].中南民族大学学报(自然科学版)，2016，35(1)：67-69.

[7] 侯晓晖，李晓飞，孙 廷. 九香虫“臭气”挥发性成分的GC-MS分析[J].广东农业科学, 2012, 18 (7):133-134.

[8] 南京中医药大学.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社, 2006:45-46.

[9] Yan Y M, Ai J, Shi Y N, et al. (±)-Aspongamide A, an N-acetyldopamine trimer isolated from the insectAspongopuschinensis, is an inhibitor of p-Smad3[J].Org Lett, 2014, 16(2):532-535.