禽类特异性引物在珠江三角洲地区的适用性研究

张杨, 吴仁人, 张一敏, 贾乐华

1. 武汉理工大学资源与环境工程学院, 武汉 430070

2. 环境保护部华南环境科学研究所, 广州 510655

3. 武汉科技大学资源与环境工程学院, 武汉 430081

4. 华南理工大学生物科学与工程学院, 广州 510006

5. 广东省水与大气污染防治重点实验室, 广州 510655

1 前言

随着我国人口的快速增长及人民生活水平的提高, 人们对畜禽产品的需求量与日俱增, 使得畜禽养殖规模不断扩大。满足了人民生活需求的同时,也给环境、生态及人类健康带来了极大的危害。大量畜禽粪便或粪便冲洗废水未经处理排入水体中,其中的氮、磷及有机质等会造成水体富营养化导致水质恶化[1], 且畜禽污水还会以多种作用方式破坏水生生态, 导致水生生物死亡, 严重威胁水产养殖业发展[2]。据调查[3], 20世纪90年代, 上海绝大部分畜牧场周围河水逐渐变为黑臭水体, 鱼类濒临灭菌。同时, 畜禽粪便未经处理排入地表水中可能会引起水源性疾病的爆发。据WHO统计, 全球每年有1800万人死于包括霍乱在内的感染性腹泻病, 90%是 5岁以下的儿童, 绝大多数发生在卫生资源较为欠缺的发展中国家; 13300万人面临肠道寄生虫感染,从而导致严重腹泻和贫血等后果, 造成每年大约9400人死亡[4]。

由于水体受粪便污染问题日益加剧, 为了能够进行及时有效地控制和治理, 以粪源污染指示菌评价水体质量得到了广泛的应用。传统的粪便指示菌通常为粪大肠菌及大肠埃希氏菌等, 但因其在生物肠道内并非优势菌群、在适宜的外界环境中可能繁殖、与致病菌联系少等缺陷, 使得拟杆菌、Faecalibaterium等专性厌氧菌在微生物污染源解析中越来越受到青睐。已有研究表明, 拟杆菌、Faecalibaterium及梭状芽胞杆菌等为人、猪、狗、牛、家禽肠道中的优势菌群[5-9], 且在自然环境中不能生存繁殖, 因此可以作为粪便微生物源解析指示菌, 避免环境中存在的微生物以及细菌自我繁殖等因素对检测结果产生干扰。同时, 以动物肠道中的优势菌群作为粪便污染指示菌, 较传统指示菌具有更高的灵敏度, 可以为生态环境的规划、治理提供及时有效的信息。

近年来, 欧美等发达国家已针对动物肠道中的优势菌群, 开发出了包括猪[8]、牛[9-10]、鸡[7]等常见畜禽养殖动物的宿主特异性源解析引物,并成功用于识别水体粪便污染源。然而, 寄居于动物肠道内的不同微生物之间相互作用极为复杂,且不同地区的气候环境、饲养条件都会导致动物肠道内的微生物丰度、结构等发生变化, 从而造成引物的适用性存在地区差异。例如, 在加拿大安大略省对野鹅粪便进行生物多样性分析发现梭状芽胞杆菌占肠道菌的 38.4%, 而在美国俄亥俄州则占28.9%[11]。在日本江别市等地区进行检测时, Okabe等[12]设计的猪源拟杆菌特异性引物Bac41F/PS183R 表现出很好的特异性, 而Mieszkin在法国布列塔尼地区进行验证时发现该引物也能与其它动物产生交叉反应。同时, 由于禽类生活、饮食习惯及飞行本能等原因, 导致其在进化中肠道构造及功能与哺乳动物相比具有明显不同, 禽类与哺乳动物肠道内的菌群结构等也具有较明显的差异[7,13]。王海鹰等[14]已在珠江三角洲地区针对哺乳动物开发的引物进行了验证,并成功挑选出适用于该地区的人、反刍动物及猪的拟杆菌特异性引物, 而关于针对珠三角地区鸡源肠道内优势菌群设计出的特异性引物验证尚未见报导, 因此本研究提取珠江三角洲地区多种畜禽粪便样品的 DNA, 选取针对鸡源肠道内不同菌群而开发的宿主特异性引物进行地区适用性验证, 为珠江三角洲地区水环境粪便污染来源分析提供一定的理论支持。

2 材料和方法

2.1 样本采集

在珠江三角洲地区东江和北江等流域的多个畜禽养殖场及广州市某医院采集家禽、家畜等动物及人的粪便样品。粪便样品数共计72份, 其中： 广东省清远市21份、广东省惠州市惠城区23份、广东省惠州市博罗县23份、广州市5份; 鸡25份、猪18份、牛6份、鸭6份、羊5份、鹅5份、鸽子1份、狗1份、人5份。所有样品编号, 保存于冰盒中, 6h内带回实验室进行样品处理。

2.2 DNA提取

采用天根公司粪便基因组 DNA提取试剂盒通过破碎、吸附柱纯化等方法提取粪便样品中的DNA。通过 NanoVue超微量紫外/可见光光度计测定所提取DNA浓度及A260/A280值, 并于-20 ℃保存备用。

2.3 PCR扩增

实验所需引物见表1。PCR 反应体系15 μL： 2×PCR DSMix 7.2 μL, 10 μmol·L-1上下游引物各 0.6 μL, DNA模板(10 ng·μL-1)0.6 μL, 超纯水 6 μL。PCR 扩增条件： 94℃·L-1变性 3 min, 94 ℃变性 30 s, 55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸90 s, 重复30个循环, 72 ℃延伸10 min。

2.4 数据分析

灵敏度(r)和特异性(s)采用以下公式进行分析：r=[TP/(TP＋FN)] ,s=[TN/(TN＋FP)][18]。其中：TP表示引物扩增自己种属样品时的阳性样本数,FN表示扩增自己种属样本时的阴性样本数;TN表示引物扩增其他种属样品时的阴性样本数,FP表示扩增其他种属样品时的阳性样本数。

3 结果与讨论

3.1 基因组DNA提取

采用试剂盒提取的粪便基因组DNA浓度、样品数以及A260/A280的比值如表2所示。粪便基因组提取的纯度是后续实验的基础, 而A260/A280比值通常用于指示样品DNA的纯度。纯DNA的A260/A280比值为1.8。当A260/A280＜1.6, 表明可能存在蛋白质等杂质污染; A260/A280＞1.9, 可能存在RNA污染[19]。对于 PCR实验而言, DNA的A260/A280理想比值应在1.8—2.0范围内[20]。由表2可知, 采用粪便基因组提取试剂盒提取的DNA纯度均符合后续实验要求, 并且具有提取效率高, 稳定性好等优势。

3.2 特异性引物的验证

表1 鸡的不同菌属特异性生物标记引物Tab. 1 Chicken-specific primers of different strains

以不同动物粪便中提取的DNA为模板, 选取已有的鸡源特异性引物, 分别进行PCR扩增。每种引物扩增后所得到的阳性结果统计及各引物的灵敏度、特异性分析结果见表3和表4。

采用Faecalibaterium通用引物(1#)对各粪便样品DNA进行扩增, 结果显示在72份样品中, 得到了63个阳性结果, 具有较高的检出率。总体而言, Faecalibaterium为鸡、鸭等禽类动物粪便中的优势菌群。如 Duan等[21]在分析禽类动物粪便中的微生物多样性时发现, Faecalibaterium在禽类肠道中的比例大于40%, 远高于拟杆菌等其它肠道微生物, 而拟杆菌则在哺乳动物肠道内含量较高[22]。禽类动物肠道的构造、长度及消化方式决定了它们与哺乳动物肠道内的微生物组成、相对丰度具有较大差异。因此, 理论上Faecalibaterium在禽类粪便中的扩增效果要优于哺乳动物。而在本研究中, 1#引物不仅对禽类粪便有较高的检出率, 对猪、牛、羊等家畜也全部检出。这说明在目标研究区域, 1#引物普遍适用于大部分畜禽动物粪便的源解析研究, 而不是仅针对禽类粪便污染源, 在初期评价水体质量时可以避免出现假阴性结果而导致低估水体受粪便污染程度。同时,应用宿主特异性引物进行源解析时, 也可以通过分析各引物与通用引物 1#之间的相关性来确定粪便污染的主要贡献源。

表2 粪便样品基因组DNA浓度, A260/A280值及样品数Tab. 2 Concentration, absorbance ratio of 260/280nm and sample number of genome DNA of fecal samples

表3 鸡源特异性引物PCR扩增结果Tab. 3 Positive results obtained with chicken-specific primers

随着微生物污染源解析技术的发展, 引物的地区适用性研究成为了该领域的重要环节之一, 而灵敏度与特异性是评价引物适用性的重要指标, 但目前仍没有针对引物评价的统一标准。在进行微生物污染源解析时, 不同引物在不同的区域内表现出的灵敏度、特异性及衰减特征都可能发生变化。Ahmed等[23]在分析多种人源拟杆菌特异性引物在不同地区适用性的研究中指出, 当引物的灵敏度和特异性均大于80%, 该引物表现较好。若引物的灵敏度小于 80%, 而特异性大于 90%, 该引物同样可以接受。本研究参照此范围对已开发的各类鸡源特异性引物进行地区适用性验证。采用鸡的 Faecalibaterium 特异性引物(2#和 3#)对不同动物粪便样品进行 PCR扩增时, 2#引物表现出了较好的特异性(100%), 但灵敏度较差, 仅为12%。而3#引物甚至未能扩增出阳性结果, 因此未能对其特异性进行评估。采用鸡的短杆菌引物(4#)对粪便样品进行验证时, 共产生 8个阳性结果。其中, 针对鸡粪的阳性结果有7个, 鸭粪 1个, 特异性达到 97%, 但灵敏度仅为 28%。验证鸡的拟杆菌特异性引物(5#、6#和 7#)时发现, 5#和 7#引物的特异性较好(分别为87%和95%), 但灵敏度较差, 仅为20%和36%。6#引物灵敏度为76%, 但其在47份产生了32个阳性扩增结果, 使其特异性较差(68%)。鸡的梭状芽胞杆菌引物(8#)在25份鸡粪样品中产生了21个阳性扩增结果, 灵敏度为84%。该引物在鸭、鹅及鸽等飞禽样品中也产生了阳性扩增, 同时与哺乳动物产生了少量的交叉反应, 其特异性仅为55%。

表4 鸡源特异性引物灵敏度与特异性分析Tab. 4 Sensitivity and specificity of the chicken-primers analyzed

Kobayashi等[13]在日本部分地区验证6#引物时发现, 该引物针对鸡肠道中的拟杆菌不仅具有较高的特异性, 同时还可以排除鸭粪样品的干扰, 这与本研究有较大差异。而Lu等[7]验证鸡的特异性梭状芽胞杆菌引物时发现, 8#引物会在禽类粪便之间出现交叉反应。从表 3可以看出, 鸡的特异性拟杆菌引物(6#)和梭状芽胞杆菌引物(8#)特异性较差的主要原因是在鸭和鹅的粪便样品中也产生了阳性扩增。这可能是由于在同一地区鸡、鸭、鹅等常见家禽的生活习惯、肠道结构及消化方式等具有一定程度的相似性, 基于这一特性将源解析的目标物种由鸡扩大至禽类, 部分特异性基因标记可以表现出较好的灵敏度及特异性(图1)。

图1 6#和8#引物在鸡和禽类中的灵敏度和特异性Fig. 1 Sensitivity and specificity of 6# and 8# primers in chicken and poultry

由图1可以看出, 6#引物对禽类粪便检测的灵敏度及特异性分别为 86%和 81%, 与针对鸡粪的检测结果相比较, 灵敏度下降了 6%, 但特异性提高了13%; 8#引物针对禽类动物粪便中基因组进行特异性扩增时, 灵敏度和特异性分别为 89%和 72%, 较鸡粪的扩增结果其灵敏度提高了 5%, 特异性提高了17%, 尽管其特异性与本文参照标准相差 8%, 但由于灵敏度已接近于 90%, 因此也可适用于目标研究区域。这一结果也说明了6#和8#引物虽然针对鸡粪样品效果较差, 但可适用于珠三角地区禽类粪便污染的源解析研究。近年来, 诸多关于动物粪便的源解析工作及流行病学研究也都将禽类归为一类作为研究对象。例如, Li等[24]在研究不同动物粪便中的致病菌时, 将家禽及野生飞鸟粪便归为一类, 将采集到的粪便混合后再进行分析。因此, 将鸡、鸭、鹅等家禽归为一类研究目标而不考虑不同禽类间的相互影响也是满足微生物污染源解析要求的。

与大肠杆菌相比而言, Faecalibaterium、短杆菌、拟杆菌及梭状芽胞杆菌在各类动物肠道中的数量远大于大肠杆菌。同时, 这些肠道中的优势菌群具有更好的宿主特异性。但不同动物肠道内优势菌群的数量及种类差异较大, 在解析粪便污染来源时应针对不同的物种而选用不同的指示菌。例如, Duan等[21]发现拟杆菌在人的肠道微生物中所占比例为 43%,在鸡和鸭中只有 12%。与此相对, 多种研究表明Faecalibaterium、短杆菌及梭状芽胞杆菌在禽类肠道中的比例占 40%—70%, 因此针对鸡粪污染进行源解析时应选取Faecalibaterium等指示菌[16,21,25-26]。

然而, 宿主肠道内的微生物容易受到不同外界环境的干扰而导致指示菌的基因发生变化, 从而造成宿主特异性引物存在较明显的地区适用性问题。例如, 本研究在珠三角地区验证的2#、3#、4#引物均存在灵敏度较差的问题, 而段传人等[15]在重庆地区验证 2#和 3#的灵敏度分别为 40%和 70%, 同时Weidhaas等[16]在美国俄克拉荷马州和佐治亚州部分地区识别出4#引物在目标研究区域同时具有较高的灵敏度和较强的特异性。因此, 即使确定了在目标研究区域所采用的指示菌, 也须通过大量的验证实验筛选针对指示菌开发的特异性引物, 避免在后续的源解析研究中产生假阳性或假阴性结果。

4 结论

1 Faecalibaterium通用引物1#(FAU)有较高的检出率, 适用于评估珠江三角洲地区粪便污染程度。

2 粪便污染源解析目标若由鸡类扩大至禽类,则6#引物的特异性提高至81%, 8#引物的灵敏度及特异性分别提高至 89%和 72%, 两种引物均适用于珠三角地区禽类粪便污染源解析。

[1] 黄海龙, 罗建新, 赵莉, 等. 畜禽粪便的环境生态效应及资源化利用[J]. 作物研究, 2007 (增)： 771-774.

[2] 汪建飞, 于群英, 陈世勇, 等. 农业固体有机废弃物的环境危害及堆肥化技术展望[J]. 安徽农业科学, 2006,34(18)： 4720-4722.

[3] 沈根祥, 汪雅谷, 袁大伟. 上海市郊大中型畜禽场数量分布及粪尿处理利用现状[J]. 上海农业学报, 1994 (增)：12-16.

[4] 李宪, 张崇淼, 王晓昌, 等. 人类特异性粪厌氧菌基因标记物实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用[J]. 环境工程学报, 2013, 7(1)： 384-388.

[5] SHEN Jian, ZHANG Baorang, PANG Xiaoyan, et al.Molecular profiling of theClostridium leptumsubgroup in human fecal microflora by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and clone library analysis[J]. Applied &Environmental Microbiology, 2006, 72(8)： 5232-5238.

[6] 王婷婷. 肠道菌群结构变化与结直肠癌发生发展关系的研究[D]. 上海： 上海交通大学, 2012.

[7] LU J, DOMINGO J S, SHANKS O C. Identification of chicken-specific fecal microbial sequences using a metagenomic approach[J]. Water Research, 2007, 41(16)：3561-74.

[8] MIESZKIN S, FURET J P, CORTHIER G, et al. Estimation of Pig Fecal Contamination in a River Catchment by Real-Time PCR Using Two Pig-Specific Bacteroidales 16S rRNA Genetic Markers[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2009, 75(10)： 3045-3054.

[9] AHMED W, POWELL D, GOONETILLEKE A, et al.Detection and source identification of fecal pollution in non-sewered catchment by means of host-specific molecular markers[J]. Water Science & Technology, 2008,58(3)： 579-86.

[10] DORAI-RAJ S, GRADY J O, COLLERAN E. Specificity and sensitivity evaluation of novel and existing Bacteroidales and Bifidobacteria-specific PCR assays on feces and sewage samples and their application for microbial source tracking in Ireland[J]. Water Research,2009, 43(19)： 4980-8.

[11] LU J, DOMINGO J W S, HILL S, et al. Microbial diversity and host-specific sequences of Canada goose feces[J].Applied & Environmental Microbiology, 2009, 75(75)：5919-26.

[12] OKABE S, OKAYAMA N, SAVICHTCHEVA O, et al.Quantification of host-specific Bacteroides-Prevotella 16S rRNA genetic markers for assessment of fecal pollution in freshwater[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,2007, 74(4)： 890-901.

[13] KOBAYASHI A, SANO D, HATORI J, et al. Chicken- and duck-associated Bacteroides - Prevotella genetic markers for detecting fecal contamination in environmental water[J].Applied Microbiology & Biotechnology, 2013, 97(16)：7427-7437.

[14] 王海鹰, 贾乐华, 吴仁人, 等. 特异性拟杆菌引物在珠江三角洲的适应性研究[J]. 中国环境科学, 2014, 34(8)：2118-2125.

[15] 段传人, 刘爱喜, 郑国铝, 等. 应用 Faecalibacterium 菌示踪水环境粪便污染研究进展[J]. 应用与环境生物学报,2013, (6)： 1073-1078.

[16] WEIDHAAS J L, MACBETH T W, OLSEN R L, et al.Identification of a Brevibacterium marker gene specific to poultry litter and development of a quantitative PCR assay[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 109(1)：334-47.

[17] CISAR C R, AKIYAMA T, HATLEY J, et al. PCR Assay Specific for Chicken Feces[J]. Proceedings of the Oklahoma Academy of Science, 2010, 90： 55-60.

[18] BALLESTÉ E, BONJOCH X, BELANCHE L A, et al.Molecular Indicators Used in the Development of Predictive Models for Microbial Source Tracking[J]. Applied &Environmental Microbiology, 2010, 76(6)： 1789-1795.

[19] 毛丹丹, 许培雅. 应用于PCR-DGGE分析的活性污泥微生物总DNA提取方法比较[J]. 环境工程学报, 2013, 7(3)：1189-1195.

[20] 赵裕栋, 周俊, 何璟. 土壤微生物总DNA提取方法的优化[J]. 微生物学报, 2012, 52(09)： 1143-1150.

[21] DUAN Chuanren, CUI Yamin, ZHAO Yi, et al. Evaluation of Faecalibacterium 16S rDNA genetic markers for accurate identification of swine faecal waste by quantitative PCR[J]. Journal of Environmental Management, 2016, 181：193-200.

[22] 张曦, 朱昌雄, 朱红惠. 利用拟杆菌分子标记物对粪便污染溯源的研究进展[J]. 微生物学报, 2011, 51(7)：863-868.

[23] AHMED W, HUGHES B, HARWOOD V J. Current Status of Marker Genes of Bacteroides and Related Taxa for Identifying Sewage Pollution in Environmental Waters[J].Water, 2016, 8(6).

[24] LI Xiang, HARWOOD V J, NAYAK B, et al. A novel microbial source tracking microarray for pathogen detection and fecal source identification in environmental systems[J]. Environmental Science & Technology, 2015,49(12)： 7319.

[25] LU J, SANCHEZ S, HOFACRE C, et al. Evaluation of Broiler Litter with Reference to the Microbial Composition as Assessed by Using 16S rRNA and Functional Gene Markers[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2003,69(2)： 901-8.

[26] ZHU X Y, ZHONG T, PANDYA Y, et al. 16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2002,68(1)： 124-37.