棉籽油脂肪酸甲酯化的方法及其脂肪酸含量分析

王 川,韩珍珍,文 凤,李艳军,孙 杰,尤春源,刘 峰,*

(1.石河子大学农学院,新疆石河子 832000; 2.石河子农业科学院棉花所,新疆石河子 832000)

棉花既是最重要的纤维作物,又是重要的油料作物。棉花的棉籽中含有25%～35%的棉籽油[1]。常用于煎炸各类食品、做各种食用调和油的原料等[2]。2014年我国棉籽油的产量为139.6万t,棉籽油消费量达139.4万t,是我国第五大食用植物油(国家粮油信息中心)。作为食用植物油的重要来源,棉籽油的脂肪酸组分和营养功能越来越受到人们的重视[3]。因饱和脂肪酸具有较低的凝固点,所以在植物油脂中,如果饱和脂肪酸组分含量过高,会使得植物油脂在较低温度下发生凝絮、浑浊、半凝固甚至凝固。同时饱和脂肪酸可能还会增加人体心血管疾病的发病几率[4]。而多不饱和脂肪酸的亚油酸与亚麻酸对人体健康是有益的,但其易氧化不稳定,在一般贮藏条件下易发生自动氧化酸败产生异味;在加热过程中易氧化形成自由基加速细胞老化,还易通过氢化作用生成反式脂肪酸,反而增加人体的心血管疾病发病率[5]。因此,对棉籽油的脂肪酸组分进行深入分析,不仅对饮食营养健康有影响,还对其加工与储藏有重要意义。

新疆是我国最主要的棉花产区,“新陆早39”与“新陆早50”是新疆本地有代表性栽培品种。新疆棉花的主副产品—棉籽加工后的棉籽油市场容量越来越大。油脂样品中脂肪酸组分相对含量的测定基本是通过气相色谱GC-MS来进行。对油脂进行GC-MS分析前,必须进行脂肪酸组分的甲酯化,甲酯化的效率也直接影响着脂肪酸的分析[6]。目前,植物油脂肪酸甲酯化常用的三种方法分别为KOH-甲醇法、H2SO4-甲醇和BF3-甲醇法。为了快速分析棉籽脂肪酸组分,本研究以 “新陆早39”与“新陆早50”的棉籽为材料,利用Soxtherm索式全自动抽提仪对其油脂进行提取,通过对三种常用甲酯化方法比较分析,并通过制作脂肪酸标准曲线,利用GC-MS外标法对两个品种棉籽的脂肪酸组分进行准确定性定量;为棉籽油的种质资源评价利用和综合加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新陆早39号和新陆早50号 石河子大学棉花所提供;37种脂肪酸甲酯混标 Sigma-Aldrich公司;正己烷(色谱纯) Merck公司;石油醚(沸程30～60 ℃)、甲醇(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、氢氧化钾(分析纯)、硫酸(分析纯)、14% BF3-甲醇溶(分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

GC-MSQP2020气象色谱-质谱联用仪 岛津公司;Soxtherm索式全自动抽提仪 德国Gerhardt公司;SY21-K型电热恒温水浴锅 北京长风仪器仪表公司;DHG-940AS型电热恒温鼓风干燥箱 宁波东南仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 棉籽中总油脂的提取 参考王美霞等的方法[7],略有改进。将棉籽去壳后,用液氮研磨粉碎,粉碎过40目筛得到棉仁粉,冷冻干燥后准确称量0.5 g干粉样品,用定量滤纸包好,将滤纸包称重后放入提取杯中。加入两颗沸石,然后加入130 mL石油醚,然后采用Soxtherm索式全自动抽提仪进行提取棉仁中油脂。提取结束后将滤纸包取出,放入55 ℃烘箱中烘干至恒重。根据滤纸包前后重量差,计算油脂提取得率。根据以下公式计算。

式中:m2为纸包提取前的质量,mg;m1为纸包提取后的质量,mg;m0棉仁粉的质量,mg。

1.2.2 棉籽中脂肪酸组分的甲酯化

1.2.2.1 H2SO4-甲醇法 参照杨艺婷等的方法[8],略有改进。将提取杯中的脂肪酸(约100 mg)加入5 mL正己烷,用塑料薄膜将提取杯封口,放置5 min,待瓶中油脂充分溶解于正己烷后,转移至10 mL血清瓶中。向血清瓶中加入1% H2SO4-甲醇5 mL混匀,置于60 ℃水浴锅水浴30 min,取出冷却至室温之后加入少许无水硫酸钠,静置30 min取上清液500 μL,作为上机分析试样。

1.2.2.2 BF3-甲醇法 参照黄铮等方法[9],略有改进。将提取杯中的脂肪酸加入5 mL正己烷,用塑料薄膜将提取杯封口,放置5 min,待脂肪酸充分溶解之后向血清瓶中加入14% BF3-甲醇5 mL混匀,置于60 ℃水浴锅水浴15 min,取出冷却至室温后加入少许无水硫酸钠,静置30 min取上清液500 μL,作为上机分析试样。

1.2.2.3 KOH-甲醇法 参照回瑞华等的方法[10],略有改进。将提取杯中的脂肪酸加入5 mL正己烷,用塑料薄膜将提取杯封口,放置5 min,向血清瓶中加入0.4 mol/L KOH-甲醇5 mL混匀,置于恒温摇床摇晃30 min,取出之后加入少许无水硫酸钠,静置30 min取上清液500 μL,作为上机分析试样。

1.2.3 GC-MS分析 GC-MS条件:HP-88石英毛细管柱(100.0 m×0.2 mm×0.20 μm);升温程序40.0 ℃保持2 min,以4 ℃/min升至240 ℃,保持15 min;柱箱温度40 ℃;进样口温度250 ℃;进样方式:分流,分流比10∶1;载气:氦气(He),初始压力500～900;流量控制方式:线速度;压力:176.6 kPa;线速度20.0 cm/s;吹扫流量3.0 mL/min;进样量1 μL;电子电离源;离子源温度200 ℃;接口温度250 ℃;监测方式为全扫描;质量扫描范围m/z 40～500;溶剂延迟时间13 min。

1.2.4 定量分析 把已知浓度的37种脂肪酸甲酯混标(Sigma-Aldrich)用正己烷(色谱纯)分别稀释成2、5、10、20、40倍。分别记作A2、B5、C10、D20、E40。直接GC-MS上机分析,各不同浓度标样GC-MS重复三次。根据稀释的五个不同浓度的标样制作标准曲线,保存此方法。使用外标法分析样品中脂肪酸甲酯的含量,通过同种标准曲线分析的方法对“新陆早39”与“新陆早50”的棉籽的脂肪酸组分进行分析,根据定量离子的响应值和建立的标准曲线进行绝对定量。

1.3 数据处理

通过NIST普库对脂肪酸组分进行定性分析,通过外标法进行定量分析,根据定量结果计算各脂肪酸组分的相对百分含量。实验数据均重复3次,取平均值,采用SPSS方法进行统计分析,EXCEL作图。

2 结果与分析

2.1 37种脂肪酸甲酯混合标准样品的GC-MS定性分析

使用GC-MS/SCAN的分析方式,得到37种脂肪酸标样的总离子流图(图1),以及37种脂肪酸甲酯的特征离子片段和相对保留时间(表1)。结果表明脂肪酸甲酯出峰时间根据碳原子的数目由少到多的顺序进行出峰。进而可根据37种脂肪酸甲酯的相对出峰时间,对“新陆早39”与“新陆早50”的棉籽中各脂肪酸组分进行定性分析;当相似度大于95%时,对脂肪酸组分进行确认。

表1 37种脂肪酸甲酯混合标准样品的GC-MS定性结果 Table 1 GC-MS qualitative analysis of 37 fatty acid methyl ester mixed standards

图1 37种脂肪酸甲酯混合标准样品总离子流图Fig.1 Total ion current of a standard mixture of 37-component fatty acid methyl esters by GC-MS

2.2 三种不同甲酯化方法对GC-MS分析的影响

通过三种不同甲酯化方法对GC-MS影响的分析,结果表明,H2SO4-甲醇法与14% BF3-甲醇法在“新陆早39”中检测到6种脂肪酸组分:豆蔻酸甲酯(C14∶0),棕榈酸甲酯(C16∶0),硬脂酸甲酯(C18∶0),油酸甲酯(C18∶1),反式异油酸甲酯(C18∶1),亚油酸甲酯等(C18∶2),在“新陆早50”中也只检测到六种脂肪酸组分(与“新陆早39”检测结果相同)。采用KOH-甲醇法进行甲酯化,GC-MS检测到了更多的脂肪酸组分,比如棉籽中一些含量很低(百分含量低于0.5%)的脂肪酸组分,如花生酸甲酯(C20∶0)和山嵛酸甲酯(C22∶0)等(图2)。

图2 三种不同甲酯化条件下的 “新陆早39”棉籽的脂肪酸组分GC-MS分析Fig.2 Fatty acid composition in cottonseed of “Xinluzao 39” methylated by three kinds of catalysts determined by GC-MS

采用KOH-甲醇法,在“新陆早39号”棉籽中检测到10种脂肪酸组分:豆蔻酸甲酯(C14∶0),棕榈酸甲酯(C16∶0),棕榈油酸甲酯(C16∶1),硬脂酸甲酯(C18∶0),油酸甲酯(C18∶1),顺式异油酸甲酯(C18∶1),亚油酸甲酯(C18∶2),花生酸甲酯(C20∶0),亚麻酸甲酯(C18∶3),山嵛酸甲酯(C22∶0)。与“新陆早39号”类似,在“新陆早50号”中除了含量极低的棕榈油酸外,其他9种脂肪酸组分均检测到。以上结果表明,相对于H2SO4-甲醇法及14% BF3-甲醇法,采用KOH-甲醇法对棉籽提取的油脂进行甲酯化,能更有效检测到棉籽的脂肪酸组分。

2.3 棉籽脂肪酸组分定量分析

根据定量分析的方法,进行标准曲线的制作。图3所示为棉籽中9种脂肪酸甲酯的校正曲线。校正曲线的纵坐标是峰面积,横坐标是浓度。在进行定量分析时采用与校正曲线相同条件,进行等量分析,在色谱图上就可以得出峰高或峰面积,进而可以计算出浓度。本研究结果显示,校正曲线相关系数高,线性结果良好,可以准确定量棉籽脂肪酸组分。我们的研究结果表明,发育成熟的棉籽中,其油脂的脂肪酸组分主要是由饱和脂肪酸的棕榈酸(C16∶0),和单不饱和脂肪酸的油酸(C18∶1)、以及多不饱和脂肪酸的亚油酸(C18∶2)等组成,这也与前人的研究相一致[11-12]。定量分析结果表明,“新陆早39”与“新陆早50”的每克棉仁油脂含量分别为245.02 mg与256.04 mg,即棉仁中的油脂百分含量分别为24.5%、25.6%。棉籽中饱和脂肪酸组分较高的为棕榈酸和硬脂酸,其它饱和脂肪酸组分含量相对较低。饱和脂肪酸含量较高的棕榈酸在“新陆早39”与“新陆早50”的含量分别为26.55%和23.24%。“新陆早39”与“新陆早50”的棉籽油脂肪酸中不饱和脂肪酸包括棕榈油酸、油酸、反式异油酸、亚油酸、亚麻酸等;其中单不饱和的脂肪酸组分油酸的含量也相对较高,在这两个品种中分别达10.12%和8.28%;其含量要略低于其他已报道棉籽中油酸的含量[13],在“新陆早39”的棉籽中还检测出棕榈油酸,其含量很低,在组分中的相对百分含量中很低,仅为0.07%(表2)。多不饱和脂肪酸以亚油酸为主,在这两个品种中每克棉仁中含量分别达到147.29 mg与163.2 mg;相对百分含量分别为60.12%和60.83%,远远超过其他脂肪酸组分,其含量高于其他已报导的棉籽亚油酸含量[14]。多不饱和脂肪酸在植物体内涉及许多生理反应,多不饱和脂肪酸参与细胞膜的组成,可调节细胞构型、动态平衡、膜的渗透性等,同时还具有一些表达调控的作用,参与脂质代谢、细胞识别、免疫反应和寒冷的适应性等生理过程[15-16]。多不饱和脂肪酸组分与低温、盐胁迫存在一定关联;同时对植物耐逆境有一定影响。积累了较高比例的亚油酸可以增强对环境的适应性,新疆相对于其他地区温度相对较低,盐碱化相对严重,所以积累了相对较高的亚油酸含量,可以增强植物耐逆性。此外,油脂中不饱和脂肪酸含量多,碘价也越高,油脂就容易氧化。在储藏过程中,由于油脂变质差生醛、酮、酸等物质发生苦味和不良气味。因此,对植物油的贮藏与加工是不利的。

表2 “新陆早39”与“新陆早50”棉籽中的脂肪酸组分Table 2 The fatty acid composition of seed oil of “Xinluzao39” and “Xinluzao39” cotton varieties

图3 脂肪酸甲酯组分GC-MS定量标准曲线及相关系数Fig.3 The quantitative standard curve and correlation coefficient of fatty acid methyl ester composition determinated by GC-MS注:C14∶0,豆蔻酸甲酯;C16∶0,棕榈酸甲酯;C16∶1,棕榈油酸甲酯;C18∶0,硬脂酸甲酯;C18∶1,油酸甲酯; C18∶1,反式异油酸甲酯;C18∶2,亚油酸甲酯;C18∶3,亚麻酸甲酯;C22∶0,山嵛酸甲酯。

3 结论

新疆的棉花产量占全国的60%,是重要的棉籽油来源地区。本研究通过对新疆本地两个棉花品种“新陆早39”与“新陆早50”的棉籽进行总油脂提取,分别采用三种常用的脂肪酸甲酯化方法:KOH-甲醇法,H2SO4-甲醇,14% BF3-甲醇法进行甲酯化后,GC-MS上机分析;并通过外标法进行定量。结果表明采用KOH-甲醇法可以检测到棉籽更多的脂肪酸,且其操作最为方便。而H2SO4-甲醇法与14% BF3-甲醇法操作不便,需要进行水浴加热,且BF3具有较强的毒性。所以KOH-甲醇法适用于棉籽脂肪酸的甲酯化,其相对优于其他两种方法。GC-MS定量分析也表明,棉籽油脂肪酸相对稳定的单不饱和脂肪酸的油酸含量约占棉籽油的8.28%～10.12%左右,而棉籽油中多不饱和的亚油酸含量高达60%左右。棉籽油作为食用植物油重要来源,本研究为棉籽脂肪酸快速测定及脂肪酸组分分析提供了数据和理论指导;对棉籽油营养评价、储藏与加工等都有一定参考意义。

[1]宋俊乔,孙培均,张霞,等.棉仁高油分材料筛选及其脂肪酸发育分析[J].棉花学报,2010,22(4):291-296.

[3]王景.棉籽仁主要营养成分近红外光谱评定研究[D].河南:河南科技大学,2012.

[4]Hou JC,Wang F,Wang YT,et al. Assessment of trans fatty acids in edible oils in China[J]. Food Control,2012,25(1):211-215.

[5]Petersen KD,Kleeberg KK,Jahreis G,et al. Comparison of analytical and sensory lipid oxidation parameters in conventional and high-oleic rapeseed oil[J]. Euro J Lipid Sci Technol,2012,114(10):1193-1203.

[6]伍新龄,王凤玲,关文强.植物油脂肪酸甲酯化方法比较与含量测定[J].食品研究与开发,2015,36(7):84-87.

[7]王美霞,周大云,马磊,等.棉籽油脂肪酸组成分析与评价[J].食品科学,2016,37(22):136-141.

[8]杨艺婷,张红城,董捷.3种甲酯化方法对GC-MS测定花粉中脂肪酸的影响[J].中国食品学报,2015,15(3):248-254.

[9]黄峥,盛灵慧,马康,等.5种脂肪酸甲酯化方法的酯化效率研究[J].中国油脂,2013,38(9):86-88.

[10]回瑞华,侯冬岩,李铁纯,等.棉籽油中脂肪酸不同的酯化方法与气相色谱-质谱分析[J].质谱学报,2005(2):90-92.

[11]杨艳,王贤磊,李冠.六种新疆陆地棉棉籽脂肪酸成分分析[J].生物技术,2009,15(4):54-56.

[12]刘冰. GC-MS分析测定5种植物油中脂肪酸成分研究[J].食品工业,2014,35(4):222-224.

[13]李勇,杨轲. 新疆地区不同产地棉籽油脂肪酸组成分析[J]. 新疆农垦科技,2013,36(12):45-46.

[14]于涵,郑晓宇,陈海玲,等.棉籽油脂肪酸甲酯的提纯及组成分析[J].中国油脂,2014,39(12):80-83.

[15]方彦,孙万仓,武军艳,等.北方白菜型冬油菜的膜脂脂肪酸组分和ATPase活性对温度的响应[J]. 作物学报,2017,19(4):1-12.

[16]孙翔宇,高贵田,段爱莉,等.多不饱和脂肪酸的研究进展[J].食品工业科技,2012,33(7):418-423.