NRAMP1基因3′UTR多态性位点与白族肺结核易感相关性研究

王桂花，何连福

（大理大学第一附属医院呼吸内科，云南大理 671000）

结核病（tuberculosis）是结核分枝杆菌（myco⁃bacterium tuberculosis，MTB）感染而引起的一种慢性传染病，病变常累及胸膜、肺脏、脊柱、肠道等多个组织器官，以肺结核（pulmonary tuberculosis）最为常见。2016年，全球约1 040万新发结核病例，死亡率22%，是全世界第十大死因，在传染性疾病中排名第一〔1〕。引起结核病的因素有营养不良、环境因素、遗传因素等，随着结核病发病机制研究的深入及分子诊断技术的发展，遗传因素诱发结核病的发生发展越来越受到关注。相关研究表明，遗传因素在结核病的发生与发展中起到一定的作用〔2〕。与结核病易感的相关基因有VDR、MBL、NRAMP1（自然抗性相关巨噬细胞蛋白1）、Sp110、TLR2、HLA等〔3-8〕。

NRAMP1基因，又称SLC11A1（溶质载体家族11成员1）基因，位于人类染色体2q35，全长14 Kb，编码550个氨基酸。大量研究发现非洲、亚洲、欧洲结核病易感性与NRAMP1的D543N、3′UTR、5′（GT）n、INT4这4个多态位点有关，且不同种族的人群均存在差异〔9-10〕。云南大理是少数民族的聚居地，而少数民族中白族人群居多。目前有关大理白族人群结核病易感相关基因的研究尚未见报道，本研究采用病例—对照研究及PCR-RFLP方法，探究NRAMP1基因的3′UTR位点多态性与大理白族人群肺结核易感的相关性，并观测患者抗结核治疗后发生不良反应的情况，为世居大理白族人群结核病易感性的评估及防治提供遗传基础依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 病例组选取2015年3月至2017年10月在大理大学第一附属医院呼吸内科确诊的白族活动性肺结核患者共193例，平均年龄（39.98±14.55）岁，男性108例，女性85例，所有患者均符合2008年中华人民共和国卫生部制定的肺结核诊断标准。对照组选取同期白族健康体检人员191人，平均年龄（37.62±10.68）岁，男性111人，女性80人。病例组及对照组在性别及年龄上差异无统计学意义（P＞0.05），存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取及检测 采集研究对象外周静脉血2～3 mL。采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取总DNA。用ND2000超微量分光光度计对提取的总DNA进行浓度测定及纯度分析，A260∕A280＞1.8及 A230∕A260＞1.7，提示提取的DNA合格。

1.2.2 PCR扩增与电泳 引物设计：参照NCBI中NRAMP1全基因序列号（NG_012128.1），用premier5.0软件设计及由金斯瑞公司合成。PCR反应体系25μL：ddH2O 9.5 μL，2× PCR mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL。见表1。

1.2.3 PCR⁃RFLP分析 PCR产物用Fok1内切酶进行酶切。酶切反应体系30 μL：PCR产物2 μL，Fok1内切酶 1 μL，ddH2O 24 μL，10×酶切 Buffer 3 μL，37℃酶切4 h。取产物上样，2%琼脂糖凝胶140 V电泳30 min，分析基因型。见表2。

表1NRAMP1基因3′UTR位点引物及PCR反应参数

表2NRAMP1基因3′UTR多态性分析

病例组患者抗结核治疗1月后检测血常规、肝肾功能，观察病例组各基因型患者不良反应的发生率。

1.3 统计学分析 Hardy-Weinberg遗传平衡分析对照组，并评估其人群代表性。使用软件SPSS 21.0统计分析数据，χ2检验，P＜0.05差异具有统计学意义。根据统计结果，以OR值（比值比）及95%可信区间评估基因多态性对肺结核发病的相对风险度。

2 结果

2.1 NRAMP1基因3′UTR多态性分析

2.1.1 PCR产物 图1A中，2～3为对照组PCR产物，5～6为病例组PCR产物。PCR扩增条带大小为244 bp，与表1中的目的片段大小一致，提示设计的引物良好，可进行PCR反应及后续酶切实验。

2.1.2 酶切产物分析 PCR产物经Fok1酶酶切后，据表2分析3′UTR位点多态性，比对PCR产物（见图1A），可确定各样品3′UTR的基因型（见图1B）。GG型：7和8为病例组，10为对照组；GA型：6为病例组，9为对照组；AA型：1～3为病例组，4和5为对照组。

图1 电泳图谱

3′UTR位点基因型频率及等位基因在两组间的分布见表3。病例组中，GG基因型占66.32%，GA基因型占27.98%，AA基因型占5.70%；对照组中，GG基因型占82.20%，GA基因型占15.71%，AA基因型占2.10%。病例组中GA型和AA型明显多于对照组（P＜0.05）。A等位基因在病例组的分布明显高于对照组（P＜0.001）。风险评估提示，A等位基因（OR=2.219，95%CI=［1.470-3.349］）是白族人群肺结核发病的危险因素。

表3 NRAMP1基因3′UTR位点等位基因及基因型分布［n（%）］

不同遗传模式下两组间3′UTR位点的基因型分布见表4。显性遗传模式下，3′UTR位点可分为GG、GA+AA，病例组中GA+AA基因型频率明显高于对照组（P＜0.01）。以GG基因型为对照，相对风险分析结果显示白族人群中存在GA+AA基因型的个体肺结核的发病风险增高（OR=2.345，95%CI=［1.466-3.751］）；隐性遗传模式下，3′UTR位点可分为GA+GG、AA，AA基因型频率在两组间的分布差异无统计学意义（P＞0.05）；加性遗传模式下，3′UTR位点可分为GG、GA和AA，GA和AA基因型频率在病例组中明显高于对照组（P＜0.05），以GG基因型为对照，相对风险分析结果提示白族人群中AA及GA基因型个体患肺结核的风险增大（OR=3.373，95%CI=［1.114-10.210］；OR=2.208，95%CI=［1.343-3.630］）。表明白族人群中NRAMP1基因3′UTR位点多态性与肺结核病相关，3′UTR位点突变增加了患肺结核的概率。

表4 不同遗传模式下NRAMP1基因3′UTR多态性位点基因型分布［n（%）］

2.2 NRAMP1基因3′UTR位点基因型分布与不良反应的相关性 193例患者出现199例次不良反应，包括胃肠道反应、肝损害、关节损害、神经系统反应、过敏反应、血液系统反应、肾损害等。从表5可知，各种不良反应在3种基因型中发生的情况，差异无统计学意义（P＞0.05）。从表6得出，野生型（GG型）与突变型（GA+AA型）患者抗结核治疗后不良反应的发生情况差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 NRAMP1 3′UTR位点基因型分布与不良反应严重性的关系 50例次发生的较重不良反应须进行临床处理，常见胃肠道反应、肝损伤、过敏反应及血液系统等症状。GG型与GA+AA型患者间须临床治疗不良反应的发生情况无明显区别（P＞0.05），见表7。临床处理后，不良症状减轻或消退，未见因不良反应而不耐受停药者。

3 讨论

本文采用病例—对照研究及PCR-RFLP方法，研究NRAMP1基因3′UTR位点多态性与大理白族肺结核易感相关性，并分析各基因型与肺结核抗结核治疗后的不良反应相关性。3′UTR位点多态性分析结果显示，病例组中突变型（GA型和AA型）明显多于对照组（P＜0.05）；等位基因分析结果表明，A等位基因（OR=2.219，95%CI=［1.470-3.349］）是白族人群肺结核病发病的危险因素；显性遗传模式下，病例组中GA+AA基因型分布显著高于对照组（P＜0.001），风险评估提示存在GA+AA基因型的白族个体患肺结核的风险增高（OR=2.345，95%CI=［1.466-3.751］）；隐性遗传模式下，两组间AA基因型分布差异无统计学意义（P＞0.05）；加性遗传模式下，突变基因型在病例组中的分布显著高于对照组（P＜0.05），风险评估显示具有GA和AA基因型的白族个体易患肺结核（OR=2.208，95%CI=［1.343-3.630］；OR=3.373，95%CI=［1.114-10.210］）。结果表明白族人群的NRAMP1基因3′UTR位点突变会引起肺结核的患病率增加及加剧病情的恶化。1998年，Bellarmy等〔11〕以西非人群为研究对象，发现NRAMP1基因的4个SNP位点［5′（CA）n、INT4、D543N和3′UTR］与结核病易感性相关；安雅臣等〔12〕以中国北方汉族人为研究对象，发现NRAMP1基因3′UTR位点多态性可能与中国北方汉族人群的肺结核易感性相关，且可影响肺结核病理学特点。以上研究结果进一步表明NRAMP1基因3′UTR位点突变与肺结核易感性相关。

表5 不同基因型肺结核患者抗结核治疗中不良反应发生情况［n（%）］

表6 野生型及突变型肺结核患者抗结核治疗中不良反应发生情况［n（%）］

表7 NRAMP1基因3'UTR位点不同基因型肺结核患者抗结核治疗中须临床处理不良反应的发生情况［n（%）］

常用的一线抗结核药有异烟肼、利福平、乙胺丁醇等，多会引起胃肠道反应、肝损伤等副作用。本文对病例组患者抗结核治疗后出现不良反应进行了统计分析，结果显示NRAMP1基因3′UTR位点不同基因型间的副作用发生率及严重程度均无明显差异。

本文仅探讨了NRAMP1基因对大理白族人群结核病易感性的作用，但引发结核病的相关因素很多，如居住条件、营养状况、细菌毒力等均增加了结核病早期防治困难，而关于结核病易感相关基因的研究有利于结核病的早发现、早诊断、早治疗，为其防治提供参考。

〔1〕WORLD HEALTH ORGANIZATION.Global Tuberculosis Report2016〔C〕.Global Tuberculosis Report，2016.

〔2〕WU L S H，LEE S W，HUANG KY，et al.Systematic Ex⁃pression Profiling Analysis Identifies Specific MicroRNAGene Interactions that May Differentiate between Active and Latent Tuberculosis Infection〔J〕.Biomed Res Int，2014：895179.

〔3〕DE MAGEE M J，SUN Y V，BRUST J C M，et al.Polymor⁃phisms in the vitamin D receptor gene are associated with reduced rate of sputum culture conversion in multidrug-re⁃sistant tuberculosis patients in South Africa〔J〕.PLoS ONE，2017，12（7）：e0180916.

〔4〕DE KNEGT G J，DICKINSON L，PERTINEZ H，et al.As⁃sessment of treatment response by colony forming units，time to culture positivity and the molecular bacterial load assay compared in a mouse tuberculosis model〔J〕.Tuber⁃culosis，2017，105（5）：113-118.

〔5〕YUAN L Y，KE Z Q，GUO Y，et al.NRAMP1 D543N and INT4 polymorphisms in susceptibility to pulmonary tuber⁃culosis：A meta-analysis〔J〕.Infect Genet Evol，2017，54：91-97.

〔6〕WU Y Y，GUO Z K，LIU F Y，et al.Sp110 enhances macro⁃phage resistance to Mycobacterium tuberculosis via induc⁃ing endoplasmic reticulum stress and inhibiting anti-apop⁃totic factors〔J〕.Oncotarget，2017，8（38）：64050-64065.

〔7〕ZHANG J W，ZHAO Z Z，ZHONG H Y，et al.Importance of common TLR2 genetic variants on clinical phenotypes and risk in tuberculosis disease in a Western Chinese popu⁃lation〔J〕.Infect Genet Evol，2018，60：173-180.

〔8〕TIWARI V，KEDIA S，GARG S K，et al.CD4+CD25+FOXP3+T cell frequency in the peripheral blood is a bio⁃markerthatdistinguishesintestinaltuberculosisfrom Crohn's disease〔J〕.PLoS ONE，2018，13（2）：e0193433.

〔9〕MEDAPATI R V，SUVVARI S，GODI S，et al.NRAMP1 and VDR gene polymorphisms in susceptibility to pulmo⁃nary tuberculosis among Andhra Pradesh population in In⁃dia：a case-control study〔J〕.BMC Pulm Med，2017，17：89.

〔10〕FERNÁNDEZ-MESTRE M，VILLASMIL Á，TAK-IFF H，et al.NRAMP1 and VDR Gene Polymorphisms in Suscepti⁃bility to Tuberculosis in Venezuelan Population〔J〕.Disease Markers，2015，2015：860628.

〔11〕BELLAMY R，RUWENDE C，CORRAH T，et al.Assess⁃ment of the interleukin 1 gene cluster and other candidate gene polymorphisms in host susceptibility to tuberculo⁃sis〔J〕.Tuber Lung Dis，1998，79（2）：83-89.

〔12〕安雅臣，冯福民，袁聚祥，等.NRAMP1基因INT4和3'UTR位点多态性与肺结核易感性的研究〔J〕.中华流行病学杂志，2006，27（1）：37-40.