高浓度葡萄糖溶液对人结肠癌上皮Caco-2细胞胆固醇吸收的影响

王 琼，王丽媛，张 莉，倪玲芬

(中国人民解放军第四医院：1.检验科；2.内科，西宁 810007)

小肠上皮细胞是具有极性的柱状上皮细胞，参与肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等过程，黏膜上皮内含有大量的免疫细胞核免疫分子，是机体内最大的免疫组织[1-3]。近年来研究发现，糖尿病患者体内血糖水平在长期得不到控制的情况下并发胆石症的概率明显升高，其机制尚未完全明确，但是与胆固醇在肠道吸收增加有明显关联[4-5]。极化的单层人结肠癌上皮细胞Caco-2被认为是与小肠上皮细胞最为相似的细胞，广泛作为小肠上皮细胞转运和代谢的体外模型使用[6]。本研究观察高浓度葡萄糖溶液对人结肠癌上皮细胞Caco-2胆固醇吸收的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 Caco-2细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞分库，DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司，胆固醇购自美国Sigma公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8试剂盒购自日本同人化学研究所，胆固醇检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。胆固醇微胶溶液配制方法：将浓度为3 mmol/L的胆盐、30 mol/L的甘油单油酸脂、1.25×105μmol/L的14C-胆固醇加入DMEM培养液中，使用超声将其混合均匀，通过0.20 μm滤膜过滤，在37 ℃保温箱保存。将胆固醇抑制剂(依折麦布)溶于0.2% DMSO中，保存于37 ℃保温箱。

1.2方法

1.2.1Caco-2细胞培养 培养基选择含有15%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5%CO2条件下进行培养，培养液2 d更换1次，直至细胞长至培养瓶容积的80%～90%，进行传代培养，选择对数期和生殖状态均比较稳定的细胞，采用10%DMSO冷冻于-80 ℃的冰箱备用。

1.2.2CCK-8检测细胞增殖 将Caco-2细胞以5×103个/孔接种于96孔板，设置5个复孔，在培养箱中放置12 h，直至细胞贴壁，分别加入浓度为12.5、100.0、300.0、700.0、1 000.0、1 388.0 mmol/L的葡萄糖溶液50 μL进行24 h培养，然后加入10 μL的CCK-8溶液，再培养2 h，使用酶标仪检测450 nm波长的吸光度(OD)值，计算细胞增殖率，确定葡萄糖溶液对Caco-2细胞的半数抑制浓度。细胞增殖率=A2+(A1-A2)/1+(X/X0)，其中A为3次OD均值，X为葡萄糖溶液浓度。

1.2.3检测Caco-2细胞胆固醇吸收量 将Caco-2细胞分为胆固醇组、胆固醇+依折麦布组、空白组。胆固醇组：向培养板中加入100 μmol/L的胆固醇溶液及5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h。胆固醇+依折麦布组：向培养板中加入100 μmol/L依折麦布和100 μmol/L胆固醇溶液及5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h。空白组：向培养板中加入DMEM培养基及对应浓度的DMSO。根据胆固醇测试说明书，使用分光光度计比色，测定OD。胆固醇浓度=(标本OD值-空白OD值)×校准品浓度/(校准OD值-空白OD值)×待测标本蛋白浓度。重复3次试验取平均值作为最终检测结果。

1.2.4WB检测ABCG8、ABCG5、NPC1L1、SR-BI蛋白表达 将Caco-2细胞分为葡萄糖组、葡萄糖+依折麦布组、对照组。葡萄糖组：分别加入5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液。葡萄糖+依折麦布组：分别加入5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液和100 μmol/L依折麦布。对照组：加入100 μmol/L依折麦布。各组均培养24 h，然后洗涤细胞，加入RIPA裂解液，对细胞总蛋白进行提取。使用BCA蛋白定量试剂对其进行蛋白定量，使用SDSPAGE凝胶制备试剂盒配制10%分离胶及5%浓缩胶，电泳，然后转运蛋白至PVDF膜，加入5%牛奶封闭2 h，加入一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育1.5 h，使用电化学发光试剂盒显影，凝胶图像系统对各蛋白条灰度值进行分析，试验操作重复3次，取平均值。以目的蛋白与内参照GAPDH灰度值的比较作为目的蛋白表达水平。

2 结 果

2.1不同浓度葡萄糖溶液对Caco-2细胞增殖的影响 CCK-8检测结果显示，葡萄糖溶液浓度为12.5、100.0、300.0、700.0、1 000.0、1 388.0 mmol/L时，Caco-2细胞增殖率分别为(1.381±0.051)%、(1.239±0.069)%、(0.737±0.031)%、(0.334±0.020)%、(0.315±0.022)%、(0.284±0.009)%，不同葡萄糖溶液浓度Caco-2细胞增殖率差异有统计学意义(P<0.05)，葡萄糖溶液对于Caco-2细胞半数抑制浓度为281.18 mmol/L。

2.2不同浓度葡萄糖溶液对Caco-2细胞胆固醇吸收量的影响 见表1。在5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液中，胆固醇组Caco-2细胞胆固醇吸收量均明显高于胆固醇+依折麦布组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但其差异随葡萄糖溶液浓度增加而减少。

表1 不同浓度葡萄糖溶液对两组Caco-2细胞胆固醇吸收量比较

2.3不同浓度葡萄糖溶液对Caco-2细胞胆固醇转运基因ABCG8、ABCG5、NPC1L1、SR-BI表达的影响 见表2。WB检测结果显示，高浓度葡萄糖对Caco-2细胞胆固醇转运基因ABCG8、ABCG5、SR-BI表达无明显影响，但对NPC1L1基因表达的影响明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 不同浓度葡萄糖溶液对两组Caco-2细胞转运蛋白表达的影响

3 讨 论

Caco-2细胞模型是一种结构和功能与分化的小肠上皮细胞非常类似的细胞，其具有微绒毛等结构及小肠刷状缘上皮相关的酶系，因此往往应用在模拟肠转运的相关研究中[7]。本研究通过Caco-2细胞的这种特性观察高浓度葡萄糖溶液对其胆固醇吸收情况的影响，以此验证高浓度葡萄糖对人体小肠细胞胆固醇吸收的影响。

胆石症是成年人好发的一种消化系统疾病，其发病率随年龄增长而升高[8-9]。胆石症的病因尚未完全清楚，但是认为所有影响胆固醇与胆汁酸浓度比例改变及造成胆汁淤滞的因素均可影响胆结石形成，因为胆汁酸减少或者胆固醇过多均可导致胆汁中的胆固醇呈现过饱和状态，从而使其沉淀析出，形成胆结石，而影响这一过程的因素有多种[10]。近年来研究表明，血糖控制不佳的糖尿病患者，其合并胆石症的概率比非糖尿病患者高1～2倍[11]。

本研究CCK-8检测结果显示，在不同浓度葡萄糖溶液中，Caco-2细胞增殖差异有统计学意义(P<0.05)，葡萄糖对于Caco-2细胞半数抑制浓度为281.18 mmol/L。Caco-2细胞增殖率随葡萄糖浓度升高而降低，在5.0、25.0L、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液中，胆固醇组Caco-2细胞胆固醇吸收量均明显高于胆固醇+依折麦布组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但其差异随葡萄糖溶液浓度增加而减少，说明依折麦布能够降低胆固醇的吸收率。从基因角度来看，WB检测结果显示，高浓度葡萄糖对Caco-2细胞胆固醇转运基因ABCG8、ABCG5、SR-BI表达无明显影响，但是对NPC1L1基因表达影响明显，且差异有统计学意义(P<0.05)。NPC1L1基因在Caco-2细胞中出现高表达，说明这是胆固醇在肠道吸收过程中起关键作用的转运蛋白，因此，在调节小肠对胆固醇的重吸收过程中起重要作用，是胆固醇吸收抑制剂依折麦布分子的作用靶点。

综上所述，高浓度葡萄糖溶液可能通过增加Caco-2细胞中NPC1L1蛋白的表达起到促进胆固醇重吸收的作用，这可能是导致糖尿病患者增加合并胆石症概率的重要因素。

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