葡萄果实MYBA1与UFGT、DFR的作用机制

牛铁泉，董燕梅，刘海霞，张小军,2，高燕,2，张鹏飞,2，梁长梅，温鹏飞,2



葡萄果实MYBA1与UFGT、DFR的作用机制

牛铁泉1，董燕梅1，刘海霞1，张小军1,2，高燕1,2，张鹏飞1,2，梁长梅3，温鹏飞1,2

（1山西农业大学园艺学院，山西太谷 030801；2果树种质创制和利用山西省重点实验室，太原 030031；3山西农业大学信息科学与工程学院， 山西太谷 030801）

【目的】转录因子在花色苷生物合成中扮演着重要角色，通过对葡萄果实发育过程中的表达和花色苷的积累模式以及与作用机制的分析，阐明花色苷合成调控机制。【方法】利用实时荧光PCR检测在葡萄果实发育过程中的表达模式；采用分光光度计测定葡萄中花色苷积累量的变化规律；用SAS8.0软件分析不同时期表达量及花色苷积累量之间的相关性；通过酵母杂交系统检测转录激活活性及其与间的作用。【结果】实时荧光定量PCR结果显示，在葡萄果实发育过程中呈现先上升后下降的趋势，在转色期（花后60—80 d）达到最大值。葡萄果实发育过程中花色苷积累量表现为先上升后趋于稳定，转色期（花后80 d）达到最大值。相关性分析结果表明，表达量与表达量呈显著正相关，花色苷积累量与表达量呈显著正相关。酵母杂交系统检测表明，具有转录激活功能，能够特异结合启动子，与编码的蛋白不具有相互作用。【结论】花色苷含量与表达量呈显著正相关，具有转录激活功能且能特异性结合的启动子，表明通过激活的启动子来调节其表达，从而调控花色苷的合成积累。

葡萄；；；；酵母杂交

0 引言

【研究意义】葡萄果皮色泽是葡萄果实重要的外观品质性状之一，也是决定葡萄酒质量的关键因素[1]，而果皮颜色主要由花色苷含量及组成成分决定[2]。花色苷的生物合成受结构基因和调节基因的控制，是一个非常复杂的过程；而且不同种葡萄乃至同品种群不同品种的着色特性不同[1]。因此，研究花色苷的合成调控机制，对提高葡萄品质以及葡萄酒质量具有重要意义。【前人研究进展】花色苷具有抗氧化、抗肿瘤、抗紫外线和防治冠状动脉心脏疾病等作用[3-5]，而且因其具有色泽鲜亮、水溶性好、安全性高等特点，有取代人工色素的趋势[6]。葡萄果实中花色苷的生物合成途径已经形成了比较清晰的轮廓[7-8]。二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR，EC:1.1.1.219）是花青素合成下游阶段的关键酶，催化二氢黄酮醇或转变成橙色到砖红色的天竺葵素糖苷，或红色的矢车菊素糖苷，或蓝色到紫色的飞燕草素糖苷[9]，但是葡萄DFR的立体结构特点，使其不能催化合成天葵色素花色苷[7-8]。因此，决定着花色苷的种类，从而影响果皮的颜色[10-12]。类黄酮葡萄糖基转移酶（UDPG-flavonoid-3-O-glycosyltranferase，UFGT，EC:2.4.1.115）是花色苷（anthocyanins）合成前体酶，催化花色素糖基化过程，形成稳定的花色素-3-单糖苷[13-14]。研究表明，UFGT的活性跟花色苷含量的积累有密切的关系[15-16]，如在苹果、红色砂梨、葡萄果实中，UFGT活性与花色苷的含量模式基本一致[16-18]。Boss等[19]和Kobayashi[14,20]研究结果也证实UFGT是花色苷合成的关键酶。通过调节的组织特异性和时空特异性的表达从而参与花色苷生物合成的调控[21-22]。【本研究切入点】研究表明，与花色苷的合成密切相关，但是对转录因子与这两个结构基因之间的结合方式以及结合位点尚不明确。【拟解决的关键问题】本文采用Real time PCR、酵母双杂交、酵母单杂交等技术，阐明与花色苷合成的相关性以及编码的蛋白与结合方式和结合位点，为明确葡萄果实花色苷生物合成提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2016—2017年在山西省园艺实验教学示范中心进行。

1.1 植物材料与菌株、试剂

选用2007年的‘赤霞珠’葡萄（L. cv. Cabernet Sauvignon）为试材。花后20 d开始，选取长势一致的植株东西两侧的上、中、下三个部位各1穗果穗，3个重复，共30穗；每隔10 d取一次，共取10次样。将采摘的果穗去除有机械伤害、病虫害及发育异常果粒后，液氮速冻，-80℃保存备用。

试验相关的所有引物均由北京华大基因合成（表1），大肠杆菌.DH5α化学感受态、高保真酶购于北京全式金生物技术有限公司，酵母表达载体、菌株和酵母培养基购于Clontech公司，质粒提取试剂盒、PCR胶回收试剂盒购于Omega公司，T4 DNA连接酶、克隆载体PMD-18T vector、反转录试剂等其他生物学试剂购于TaKaRa公司。

1.2 总RNA提取及实时荧光定量PCR分析

采用改良的CTAB法[23]提取葡萄总RNA，用1%的琼脂糖检测质量及完整性后按照TaKaRa反转录合成试剂盒说明书，500 ng的RNA被用来反转录，再将反转录获得的cDNA稀释至100 ng∙µL-1待用。以葡萄持家基因（，登录号：BN000705）为内参，使用premier5.0设计引物（表1），利用real-time PCR仪分析葡萄果实发育过程中（登录号：AB097923.1）、（登录号：X75964.1）和（登录号：X75968.1）的表达模式。反应体系为20 µL，其中含有SYBR Premix Ex Taq（2x）10 µL，cDNA 1 µL，上、下游引物各0.8 µL（0.4 µmol∙L-1），ROX 0.4 µL，ddH2O 7 µL。反应条件为预变性95℃3 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环。设置在72℃1 min处收集荧光信号，试验重复3次。

1.3 花色苷含量的测定

花色苷提取参照田莉[24]的方法，分析方法参照刘晓静等[25]的方法，将在520和540 nm波长下吸光值的差作为花色苷含量，差值按每0.01为一个单位（U）设定。

表1 引物序列

下划线部分为内切酶序列

The underline part is the endonuclease sequence

1.4 酵母载体构建

根据和核苷酸序列和pGBKT7、pGADT7多克隆酶切位点设计引物（表1）。以实验室前期获得的含‘赤霞珠’葡萄CDS序列的克隆质粒为模版进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳分析及测序验证PCR产物。将获得的阳性克隆扩繁提取质粒，用相应的内切酶将获得的阳性克隆载体和pGBKT7、pGADT7进行双酶切并回收，用T4 DNA连接酶16℃条件下过夜连接，获得重组质粒pGBKT7-、pGBKT7-、pGBKT7-、pGADT7-，然后转化Trans-5α化学感受态细胞。经菌液PCR和双酶切验证正确的菌液送往华大科技公司测序。

从葡萄基因组数据库（http://www.genoscope.cns. fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中获得、启动子序列，用启动子分析软件PLANTCARE预测启动子上的作用元件（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/），获得与MYB结合的MBS顺式作用元件，将MBS顺式作用元件串联获得诱饵元件序列，MBS顺式作用元件突变为阴性对照（-MBS：TAGGGCAACATTGAGACAACTGC AGGTTAAGGTCTGTTTGATAACTGTTTTATAAAACAGTTATAGATGACAACCCCCATGCAGTTGCCACTCTCACAAC；-Mutant：TAGGGCAACATTG AGAACCATGCAGGTTAAGGTCTGTTTGAATTCCCTTTTATAAAAGGGAATTAGATGACAACCCCCATGCCGAACCCACTCTCACAAC；-MBS：GACC GTAGCTCACCGTGGCAACTGGCCGATGGTGGCTCGTGGGTTCAGTTGTCACTTTTGACACACCACCAACAGTTGCCCGTCTAAACG；-Mutant：GACCG TAGCTCACCGTGGACCATGGCCGATGGTGGCTCGTGGGTTCCGAACTCACTTTTGACACACCACCAACCGAACCCCGTCTAAACG），由上海生物工程有限公司合成重组诱饵载体pMBS（）-AbAi、p[Mutant（）]-AbAi（阴性对照）、pMBS（）-AbAi、p[Mutant（）]-AbAi（阴性对照）。

1.5 转录激活功能分析及毒性检测

选取验证正确的重组质粒pGBKT7-、pGBKT7-、pGBKT7-，采用PEG/LiAC法将pGBKT7-、pGBKT7-、pGBKT7-质粒分别转入酵母感受态AH109细胞中，以转入pGBKT7空质粒为阴性对照，pGBKT7-P53为阳性对照，分别均匀涂于SD/-Trp单缺陷平板上，结合菌液PCR筛选转化子，再涂于SD/-Trp/X-α-Gal显色平板上，30℃倒置培养2—4 d，观察颜色变化。

1.6 酵母双杂交

参照Clotech产品说明书，采用PEG/LiAC法将pGBKT7-pGADT7-、pGBKT7-pGADT7-、pGBKT7-T/pGBKT7-53、pGBKT7-pGADT7、pGBKT7-pGADT7质粒分别共转入酵母感受态AH109细胞中，1/2均匀涂于SD/-Trp-leu二缺性平板上，1/2均匀涂于SD/-Trp-leu- His-Ade四缺性平板上，30℃倒置培养2—4 d，待菌落长出后转入含有X-α-Gal显色四缺平板上作进一步验证。

1.7 酵母单杂交

将用I酶线性化后的pMBS（试验）-AbAi [pMBS（）-AbAi、pMBS（）–AbAi]、pMBS（阴）-AbAi{p[Mutant（）]-AbAi、p[Mutant（）]-AbAi}、p53-AbAi质粒采用PEG/LiAC法转入酵母菌株Y1H-gold感受态细胞中，在转化了Y1H-gold [pMBS（试验）-AbAi]的平板分别挑取一株状态较好菌落于10 µL ddH2O中混匀，取1 µL菌液滴加在SD/-Ura、SD/-Ura/50 mmol∙L-1Aba、SD/-Ura/100 mmol∙L-1Aba、SD/-Ura/200 mmol∙L-1Aba平板上，30℃倒置培养3—5 d，观察生长状态。观察发现Y1H-gold [pMBS（试验）-AbAi]在SD/-Ura/100 mmol∙L-1Aba平板上不再生长，表明可在此条件下展开下步验证试验。

从上述平板上分别挑取Y1H-gold [pMBS（试验）-AbAi]、Y1H-gold [pMBS(阴)-AbAi]、Y1H-gold[p53- AbAi]单菌落（直径2—3 mm），分别于YPDA培养基中扩繁，并获得其感受态细胞，再将pGADT7-、pGADT7-、pGAD-Rec-p53质粒分别转化到上述感受态细胞中。将转化后菌液各取100 µL分别涂布SD/-Ura/-Leu/100mM Aba，30℃倒置培养3—5 d，观察生长情况。

2 结果

2.1 葡萄果实发育过程中VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR表达规律

葡萄果实发育过程中，的转录表达规律如图1所示。在整个果实发育过程中，的表达量整体呈现先上升后下降的趋势，均在转色期（花后60—80 d）表达量较高。

2.2 葡萄果实发育过程中花色苷积累规律

花色苷在赤霞珠葡萄果实发育过程中积累表现为幼果期无积累，转色后快速积累，在花后80 d达到最大值，之后略微下降，但趋于平稳（图2）。

2.3 相关性分析

的表达水平与花色苷的积累量呈显著正相关，且的表达与的表达呈显著正相关（表2）。表明‘赤霞珠’果实发育过程中，表达与表达密切相关。异位表达导致红色素积累和表达上调[26]，可能对、表达具有调控作用；而且花色苷的积累是在调控下完成。

表2 相关性分析

**：在0.01水平上显著；*：在0.05水平上显著

**: Significant correlation at 0.01 level; *: Significant correlation at 0.05 level

2.4 VvMYBA1、VvUFGT、VvDFR转录激活功能分析以及毒性检测

分别将pGBKT7-、pGBKT7-、pGBKT7-、pGBKT7-P53（阳性对照）、pGBKT7 （阴性对照）转入酵母感受态细胞AH109中，将其分别涂于SD/-Trp单缺陷性平板上均能生长且长势基本一致，说明所有质粒成功转入酵母菌株AH109中，且无毒性。将含有上述质粒的转化子涂于SD/-Trp/X-α-Gal显色平板上进行显色反应，结果表明，含阳性对照和pGBKT7-的转化子均能显现明显的蓝色，阴性对照和pGBKT7-、pGBKT7-的转化子未显蓝色，表明编码的蛋白具有转录激活功能，编码的蛋白不具有转录激活功能（图3）。

图2 葡萄果实发育过程中花色苷含量的变化

2.5 酵母双杂交分析

以pGADT7-分别与pGBKT7-、pGBKT7-共转化入酵母AH109感受态细胞中为试验组，pGBKT7-T与pGBKT7-53共转化入酵母中为阳性对照，pGADT7分别与pGBKT7-、pGBKT7-共转化入酵母菌中为阴性对照，并将其涂于SD/-Trp-leu二缺性平板和SD/-Trp-leu- His-Ade四缺性平板上，在二缺平板上试验组和对照组菌落长势良好（图4-A），说明质粒均成功转入酵母菌中；而在四缺培养基上，只有阳性对照才能生长，试验组和阴性对照均不能生长，说明在酵母水平中，MYBA1蛋白与UFGT、DFR蛋白均不互作（图4-B）。

2.6 酵母单杂交分析

将启动子的MBS元件连接到pAbAi质粒上为pMBS()-AbAi、pMBS()- AbAi重组质粒，以pGADT7-分别与pMBS ()-AbAi、pMBS()-AbAi共转化入酵母菌Y1Hgold细胞中作为试验组；将pGADT7-分别与p[Mutant()]-AbAi、p[Mutant()]-AbAi共转化入Y1Hgold酵母菌中为阴性对照；将p53-AbAi与pGAD-Rec-p53共转化入酵母菌中为阳性对照。分别将试验组、阳性对照和阴性对照涂于SD/-Ura/- Leu/100 mmol·L-1Aba固体平板上，结果显示，试验组与阳性对照均能在固体平板上生长，而阴性对照不能生长，说明编码的蛋白能够特异性结合启动子序列（图5）。

图3 转录激活活性分析

1：阳性对照；2：pGADT7- MYBA1和pGBKT7-DFR共转化的转化子；3：pGADT7-MYBA1和pGBKT7-UFGT共转化的转化子；4：pGADT7和pGBKT7-DFR共转化的转化子；5：pGADT7和pGBKT7-UFGT共转化的转化子

3 讨论

花色苷生物合成相关的基因分为结构基因和调节基因两类。其中，结构基因直接编码花青素/苷生物合成过程中生物合成酶类（如等）；调节基因则通过调控花青素/苷生物合成结构基因的表达强度和模式，调控花青素/苷的时空积累（如等）[27]。Rinaldo等[28]的研究表明调节葡萄花青素酰基转移酶的表达，使葡萄果皮中花青素酰基化水平提高。‘巨峰’葡萄的cDNA进入体细胞胚中，可以引发红紫色斑点，表明在花青素生物合成中起关键作用[29-30]。通过对苹果、葡萄等研究表明，表达强度以及酶活性与花色苷积累量有关[15-16,19,31-32]。不仅决定着花青素/苷的种类，而且还是花青素/苷合成的入口酶[7-8,10-12]。王海竹等[33]研究发现，和在紫萼长茄果萼中表达明显高于绿萼长茄，推测和参与花色苷的生物合成。Nakatsuka[34]、Takos等[35]指出，经过上调的基因表达从而提高苹果中花色素的含量，而可以同时调控和这两类结构基因。在葡萄中，也被发现可以诱导表达[29-30]，且在白色葡萄中不表达，只在有色葡萄品种的果皮中表达[36]。本文通过实时荧光定量和相关性分析研究发现，在‘赤霞珠’葡萄果实中，表达量与花色苷积累量呈正相关，且转录因子与结构基因表达强度之间呈正相关，这一结果与前人研究结果基本一致[19,21-22,29-31]。

1：阴性对照；2：试验组；3：阳性对照

在转录水平上，植物常通过转录因子来调控目的基因的表达，从而调控其次生代谢、应答激素和环境胁迫等[37]，且大多数转录因子具有转录激活功能[38]。酵母杂交试验表明，转有重组质粒pGBKT7-的酵母转化子可以在SD/-Trp/X-α- Gal显色平板上呈现明显的蓝色，因此，具有明显的转录激活功能。而在SD/-Trp/X-α-Gal显色平板上不能够呈现蓝色，且长势与对照基本一致，说明pGBKT7-、pGBKT7-无毒性且不能自激活，因此可以作为酵母双杂交的诱饵载体。

植物中MYB家族转录因子与MYB顺式作用元件的结合已有广泛研究，如特异性结合MYB核心序列T/GAACTG/A[39]，可以识别结合TAACTG[40]，则特异性识别GGTAGGT[41]。前人研究结果可知，通过调节的时空表达[19,21-22,29-31]，笔者前期研究结果同样也证实了这一点（数据待发表），但与的结合位点，特别是其调控机理尚未明确。和启动子分析结果显示有多种与生物胁迫和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件，其中MBS顺式作用元件在启动子中有两处（+62，-796），且均为CAACTG；而启动子中有4处MBS位点（+54，+443，-459，-1411），CAACTG和TAACTG顺式元件各有两处，将MBS顺式作用元件串联作为酵母单杂交的诱饵载体，CAACTG核心序列在诱饵载体中重复3次。通过酵母双杂和酵母单杂试验得出，编码的蛋白与编码的蛋白不具有相互作用，但能特异结合启动子的CAACTG顺式作用元件和启动子的CAACTG或TAACTG顺式作用元件。根据SD/-Ura/-Leu/100 mmol∙L-1Aba固体平板上的长势，可以得出编码的蛋白与启动子作用强度高于启动子。因此，编码的蛋白可能只识别结合CAACTG顺式作用元件，而不能够识别结合TAACTG顺式作用元件。

4 结论

、、表达模式为先上升后下降的趋势，花色苷积累表现为转色期（花后60 d）急聚增长，之后趋于平稳，且、表达量与花色苷积累量为显著正相关，、表达量与表达量为显著正相关。具有转录激活功能，编码的蛋白不能与VvUFGT、VvDFR蛋白相互作用，但能与、的启动子结合，表明可能通过激活的启动子来调控其表达，从而调控葡萄果实发育过程中花色苷的积累。

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（责任编辑 赵伶俐）

The Regulations of thefrom the Grape Berries

NIU TieQuan1, DONG YanMei1, LIU HaiXia1, ZHANG XiaoJun1,2, GAO Yan1,2, ZHANG PengFei1,2, LIANG ChangMei3, WEN PengFei1,2

(1College of Horticulture，Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Shanxi Key Laboratory of Germplasm Improvement and Utilization in Pomology, Taiyuan 030031;3College of Information Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi)

【Objective】transcription factor plays an important role in the biosynthesis of anthocyanins. To further explore the synergistic regulatory mechanism of anthocyanins, we analyzed the mutual mechanism and expression pattern of,,and content of anthocyanins during grape berry development.【Method】The real-time PCR, spectrophotometer and SAS8.0 were used to analyze the expression patterns of,,content of anthocyanins and correlation in different time periods, respectively. The transcriptional activity ofand the interactions between theandwere determined by yeast hybrid system. 【Result】The expression pattern analysis showed that the expression of,was increased until veraison (60-80 d after full bloom) and then declined. The content of anthocyanins was fist increased until veraison (80 d after full bloom) and then stabilization. Correlation analysis showed that the expression ofwith expression ofthe,had positive correlation, and the content of anthocyanins with the expression of,,had positive correlation. Yeast hybrid assay indicated thathad transcriptional activation functions which could specifically combine promoter ofand had no interaction withandencoded proteins.【Conclusion】The content of anthocyanins was significantly correlated with expression of,, andThehad transcriptional activation functions. All results indicated thatcould regulate the accumulation of anthocyanins in grape berry development by regulatingandexpression combined withandpromoter specifically.

grape;;;; yeast hybrid system

2017-10-17；

2018-04-01

国家自然科学基金（31372013）、山西省科技重点研发（指南）项目（201603D21105-8）、山西省重点研发计划重点项目（201703D211001-04-02）、山西省科技成果转化项目（201604D132034）

牛铁泉，Tel：0354-9285900；E-mail：niutiequan@126.com。董燕梅，E-mail：15501877836@163.com。牛铁泉和董燕梅为同等贡献作者。

温鹏飞，Tel：0354-6289332；E-mail：wenpengfei@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.12.013