犬高频起搏诱发心房颤动模型心房电活动及神经重构机制研究*

胡嘉禄 唐敏娜 张峰 敖登 雷芾华

心房的电重构、神经重构和结构重构在触发和维持心房颤动(atrial fibrillation，AF)中发挥着重要的作用[1-3]。目前国内外制作自主神经介导AF的模型，均是用400～500次/分(bpm)频率起搏心房，并同步刺激心脏自主神经[4-5]。以此方法制作的自主神经介导AF的动物模型，同时有心房肌的神经重构和电重构，因此无法单独解释神经重构介导的AF发生机制。已有基础和临床研究研究报道，以1 200 bpm频率起搏右房，因起搏频率短于心房不应期而不能夺获心房，故而可以单独刺激心房内神经丛，制作心脏自主神经单因素诱导的AF模型[6]。笔者通过比较500 bpm和1 000 bpm频率起搏高位右房、刺激右位迷走神经干(RVNT)对AF的诱发和维持，以及对心房肌电重构及神经重构的影响，阐明1 000 bpm频率起搏高位右房在制作心脏自主神经介导AF模型中的作用，以及指导临床干预自主神经治疗AF的潜在价值。

1 材料与方法

1.1实验动物和麻醉 动物中心提供健康成年比格犬48条，雌雄不限，体重15～20 kg，随机平均分为6组，每组8只。A组：对照组，以105%基础心率频率起搏高位右房(夺获心房)；B组：以500 bpm频率起搏高位右房；C组：以1 000 bpm频率起搏高位右房；D组：刺激RVNT；E组：以500 bpm频率起搏高位右房+刺激RVNT，F组：以1 000 bpm频率起搏高位右房+刺激RVNT。术前采用超声心动图，排除瓣膜型心脏病和先天性心肌病等器质性心脏病。研究方案经过动物伦理审查(IACUC-20170325009)。术前12 h禁食,6 h禁饮,氯胺酮(20 mg/kg)基础麻醉，3%戊巴比妥钠泵维持麻醉。备皮、固定、气管插管和辅助呼吸，氧流量4～6 L /min、潮气量10 ml /kg。Lead7000电生理仪(四川锦江电子科技有限公司)Ⅱ导联记录和监测体表心电图,监测生命体征。

1.2高位右房起搏和心电活动记录 分离右侧颈外静脉，经右侧颈外静脉置4极电极导管于高位右房，记录高位右房内心电图。取卧位,沿左侧第四肋间开胸,切开心包暴露心脏。分别将4极导管缝在左上肺静脉、左下肺静脉和左心耳，记录清晰的局部的心内膜电位，关闭胸腔。使用 DF-3A 型电生理刺激仪(苏州中国东方电子仪器厂)，以105%基础心率、500 bpm和1 000 bpm的刺激频率，2倍舒张期阈值电压，2 ms脉宽，S1S1模式持续起搏高位右房12 h，并记录体表心电图。

1.3AF诱发率和AF持续时间测定 AF诱发方法：起搏后每2 h，使用电生理刺激仪，以300 ms Burst刺激高位右房30 s，重复刺激诱发5次，记录AF的诱发次数和持续时间。AF定义为心房无序的电活动,心电图表现为P波消失,代之以大小不等、间隔不均、形态不一的f波,频率450～600次/分,RR间期不等,持续5 s以上，自发或诱发出的AF持续时间≥5 min为持续性AF。AF诱发率=成功诱发次数/总诱发次数，AF持续时间=总AF持续时间/AF诱发次数。

1.4心内电生理指标测定 ①有效不应期(ERP)测定：高位右房起搏后，每2 h测定右房的ERP。ERP测定：S1S2以300 ms/280 ms开始，以步长5 ms递减，直至不能夺获心房的最长S1S2间期，测量3次ERP取其均值。

②ERP离散度(ERPd)计算：本研究取各时间点左右心房的ERP最大值减去最小值代表ERPd。

1.5心率变异性(HRV)测定 电生理仪监测体表心电图(ECG),每次待心电信号稳定后，使用LabChart7软件，记录起搏后每2 h的ECG。每次分析0.5 h内的HRV的高频(HF)与低频(LF)成分之比(HF/LF)。

1.6神经刺激及神经信号记录 右侧颈部切开皮肤，分离犬RVNT并置入双极针状电极，并用自制神经信号记录电极采集迷走神经干信号,固定电极并缝合皮肤。锁骨上窝切开皮肤，逐层分离暴露星状神经节(SG)，并固定自制神经信号记录电极于SG，缝合皮肤。连接双极针状电极于Grass刺激仪上(赞德仪器有限公司) ，以1～8 V电压, 20 Hz频率, 0.05～0.1ms脉宽，刺激RVNT至心率显著降低50%基础心率。神经信号记录电极连接Powerlab电生理记录仪(AD Instruments公司)， 采集并记录神经放电信号。采用LabChart Pro专业版数据采集分析软件，分析起搏前后每2 h的SG和RVNT的放电信号幅度、信号面积和放电时程，每小时任取300 s神经信号图形做分析。

1.7统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行常规统计，计量资料采用均数±标准差表示，计数资料采用构成比表示，组间比较采用重复测量的方差分析，两两之间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1AF诱发率及AF持续时间 48条犬均完成实验。高位右房起搏2～6 h，各组AF诱发率，随着起搏时间的延长而显著增加(P<0.05)，起搏8 h后，AF的诱发率将不再显著增加(P>0.05)。与A组比较，B、D组各时间点AF诱发率显著增加。与B组比较，C、E组AF诱发率显著增加。与C组比较，F 组的AF诱发率显著降低(表1)。

各组AF维持时间，随着起搏时间的延长而显著增加(P<0.05)。与A组相应时间点比较，B组的AF维持时间增加，但没有达到统计学意义(P>0.05)。与A和B组相应时间点比较，C组的AF维持时间显著增加(P>0.05)。与A组相应时间点比较，D组的AF维持时间显著增加(P>0.05)。与B组相应时间点比较，E组的AF维持时间显著增加(P>0.05)。与C组相应时间点比较,F组的AF维持时间显著减少(P>0.05)(表2)。500 bpm起搏高位右房，右房心内电激动表现为颤动传导，而左房心内膜电激动表现为规整的心房传导。1 000 bpm起搏高位右房，左右心房的心内电激动均为激动颤动传导(图1)。

表1 起搏不同时间右房AF诱发率/%(n=40)

注：与A组相应时间点比较,*和▲P<0.05。与B组相应时间点比较，※※和▲▲P<0.05。与C组相应时间点比较，△P<0.05

表2 起搏不同时间右房AF维持时间/min(n=40)

注：与B组相应时间点比较,*和▲P<0.05。与A组相应时间点比较，※※P<0.05。与C组相应时间点比较，△P<0.05

2.2心房肌ERP及ERPd改变 高位右房起搏2～6 h后，各组的AERP均显著缩短，8 h缩短达到高峰(P<0.05)。与A组相应时间点比较，B组的ERP缩短程度显著增加P<0.001。与A组相应时间点比较，C组的ERP缩短程度显著增加,但与B组相应时间点比较，ERP缩短程度显著显小。与A组相应时间点比较，D组的ERP缩短程度显著增加P<0.05。与B组相应时间点比较，E组的ERP缩短程度显著增加P<0.001(表3)。

高位右房起搏，右心房ERPd均出现显著变化，与A组相应时间点比较，B、C、D、E和F和的ERPd显著增加，但B组和E组的ERPd显著大于其它各组(P<0.001)(表4)。

2.3神经信号变化 各组在各观察时间点，均有神经信号的动态变化。A组的RVNT神经放电幅值大于SG。B组的RVNT和SG神经放电幅值同等，与基础对照，没有显著增加。C组的SG神经放电幅值显著增加，RVNT神经放电幅值显著减小。D组的RVNT和SG放电时程等同减少，RVNT神经放电幅值强于SG放电幅值。与B组比较，E组的RVNT和SG神经放电幅值等同减少，但放电时程显著增加。与C组比较,F组的SG放电幅值显著减小，RVNT神经放电幅值增加(图2)。

A图：500 bpm高右房起搏诱发AF，高右房1,2电极(HRA1-2)显示心房颤动传导，左心耳1,2电极(LAA1-2)和左下肺静脉1,2电极(LIPV1-2)显示心房规则的房性心动过速传导和房-室(A-V)1∶1传导。B图：1 000 bpm右房起搏诱发AF，LAA1-2和LIPV1-2，显示心房颤动传导

2.4HRV的HF/LF变化 起搏12 h后，与A组相应时间点比较，B组的HF/LF值无显著变化。与A、B组比较，相应时间点比较，C组的HF/LF值显著减小(P<0.05)。与A组相应时间点比较，D组的HF/LF值显著增加(P<0.05)。与B组相应时间点比较，E组的HF/LF值显著增加(P<0.05)。与C组相应时间点比较，F组的HF/LF值增加(P>0.05)(表5)。

3 讨论

为探究AF发生发展的电重构和神经重构机制，建立符合临床AF病因与发病机制的模型至关重要[1]，AF模型的临床疾病代表性是目前关注的重点。

快速起搏心房制作动物AF模型已有近50年的历史，400～600 bpm频率起搏是当今多数研究中心采用的制作心房肌“电重构”改变为主的AF模型的方法。起搏心房并同步电刺激RVNT、心脏神经丛、SG和肾交感神经等，或施以干预自主神经的药物如阿托品和去甲肾上腺素等，能够将AF模型的诱发率从20%提高到89%，也是当前国内外制作自主神经介导AF模型共识的方法[6-8]，然而该模型因同步起搏心房和电刺激神经，产生了心房肌的神经和电重构共存改变，无法解释神经重构单一因素介导AF的发生机制。

表3 起搏不同时间右房ERP缩短程度/%(n=8)

注：与A组相应时间点比较,*P<0.05;※※P<0.05。与A组相应时间点比较，▲P<0.05。与B组相应时间点比较，▲▲P<0.001

表4 起搏不同时间右房ERPd变化/ms(n=8)

注：与A组相应时间点比较,※P<0.001;※※P<0.05;▲P<0.05;▲▲P<0.001;△P<0.05

本研究观察了犬500 bpm和1 000 bpm起搏高位右房、刺激RVNT、500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT和1 000 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，干预12 h，右房的AF诱发率和维持时间、AERP、AERPd、HF/LF、RVNT和SG的神经信号变化。笔者发现：500 bpm起搏高位右房，主要产生心房肌的电重构改变。1 000 bpm起搏高位右房，心房肌产生以交感神经重构为主的改变。RVNT产生迷走神经重构为主的改变。500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，产生迷走神经重构合并电重构为主的改变。

A组：RVNT(蓝色)神经放电幅值大于SG(红色)。与A组比较，B组的SG和RVNT神经放电幅值没有显著增加；C组的SG神经放电幅值显著增加，RVNT神经放电幅值显著减小；D组的RVNT神经放电幅值显著增加，SG放电幅值显著减小；E组的RVNT和SG放电幅值等同减少，RVNT放电幅值大于SG放电幅值，但放电时程显著增加。与C组比较，F组SG放电幅值显著减小，RVNT神经放电幅值增加

笔者提出以500 bpm起搏高位右房，1 000 bpm起搏高位右房，刺激RVNT或500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，分别可以制作出心房电重构、交感神经重构、迷走神经重构以及迷走神经重构合并心房电重构的AF模型。

3.1500 bpm起搏高位右房诱发AF 本研究发现，500 bpm起搏高位右房，右房出现了不规则的颤动传导，而左房仍然是规律的激动传导，这种左右房间的电激动的传导差异，造成了心房AERPd显著增大。Allessie等[9]的研究发现，400 bpm起搏左房诱发AF，左右心房的AERP缩短不显著，但AERPd显著增大，认为决定AF易感性的因素是AERPd，而非AERP缩短。笔者的研究还发现，500 bpm起搏高位右房诱发AF,HF/LF比值和SG及RVNT神经活动变化不显著，提示500 bpm起搏高位右房诱发AF时，心房肌出现AERPd显著增大的电重构改变，而无显著的神经重构。 因此笔者认为，500 bpm起搏犬高位右房，可以制作电重构AF模型，用以研究AF的电重构机制，也提示在临床心房肌平均颤动频率较低的AF患者，难以从增加干预心脏自主神经治疗策略获益。

3.2刺激RVNT诱发AF 本研究发现，单纯刺激RVNT，能够诱发18%～25%的AF发生，500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，AF的诱发率显著增加到58%～80%。刺激RVNT诱发AF时，心房肌的ERP和ERPd的电重构改变不显著。500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT诱发AF时，心房肌出现显著的ERP缩短和ERPd增大的电重构改变。1955年Hoff等[10]用起搏心房并刺激胆碱能神经纤维或心脏灌流乙酰胆碱，制作了“迷走神经介导的AF”模型。认为刺激迷走神经，增加了心房AERP的缩短、AERPd 增加和电传导异常。本研究进一步观察到，刺激RVNT和500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，HF/LF比值显著增大，RVNT的神经活动显著增加，提示出现了显著的迷走神经重构的改变。笔者认为，刺激RVNT，可以制作“迷走神经触发AF”的动物模型，用于研究“迷走神经重构AF”的机制。500 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，可以制作“迷走神经介导AF”模型，用于研究“迷走神经重构并心房肌电重构AF”机制研究。提示临床上“迷走神经触发AF”，干预迷走神经，可以获得最佳治疗效益。“迷走神经介导AF”，肺静脉电隔离消融术+迷走神经消融策略，有可能获益更多。

表5 起搏不同时间HRV(HF/LF)比值变化(n=8)

注：与A组相应时间点比较,※、▲、△P均<0.05

3.31 000 bpm起搏高位右房诱发AF Schauerte等[11]研究表明：高频电刺激肺静脉神经节丛,可以引发肺静脉局部电活动增强,从而有利于AF诱发。Scherlag等[12]研究显示：刺激含有神经节丛的心外膜脂肪垫，能在房性早搏刺激的基础上诱发AF。近来有研究报道，以1 200 bpm短于心房肌不应期的快频率起搏右房，因刺激不能夺获心房肌，可以获得刺激心房内的自主神经的效应，易化AF的诱发，可以制作心房肌重构AF模型[6，13]，然而对其制作AF模型的可靠性、确切的神经电生理机制，尚无研究报道。

本研究发现，1 000 bpm起搏高位右房,AF的诱发率在57%～79%，AF的维持时间在5～30 min，显著高于500 bpm起搏高位右房。1 000 bpm起搏高位右房，心房肌的ERP和ERPd变化不显著，但HF/LF比值显著降低，SG神经活动信号明显增强。1 000 bpm起搏高位右房+刺激RVNT，显著降低1 000 bpm起搏高位右房的AF诱发率和维持时间，显著逆转了1 000 bpm起搏高位右房HF/LF比值的降低和SG神经活动信号的增强。提示1 000 bpm起搏高位右房诱发AF时，心脏交感神经发生了显著的重构，增加刺激RVNT,抵消了交感活动的增加。本研究表明，1 000 bpm起搏高位右房，可以制作“交感神经张力异常AF”的模型，用于AF交感神经重构机制的研究。提示在临床心房肌颤动频率较高的AF患者，可以获益于干预心脏交感神经治疗。

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