糖尿病大鼠髌腱来源肌腱干细胞体外成脂分化潜能的实验研究

徐宏亮，石柳，李荥娟，徐林，王宸,3,4，陈辉,3,4，芮云峰,3,4

(1.无锡市锡山人民医院 骨科，江苏 无锡 214000； 2.东南大学附属中大医院无锡分院 骨科，江苏 无锡 214000； 3.东南大学附属中大医院 骨科，江苏 南京 210009； 4.东南大学创伤骨科研究所，江苏 南京 210009； 5.香港中文大学 矫形外科及创伤学系，香港； 6.东南大学附属中大医院 老年科，江苏 南京 210009)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)作为机体内分泌系统的常见疾病，除了本身高血糖特征以外，还会导致多个系统并发症的发生[1]。目前越来越多的研究证实，持续的高血糖也会导致骨骼肌肉系统发生病变，而肌腱作为骨骼肌肉系统的重要组成，DM对其的影响尚未被深入研究。前期我们通过文献综述发现，DM肌腱的组织学形态发生病理改变以及生物力学特性较正常肌腱降低，而在细胞与分子生物学水平的变化还有待进一步研究[2]。我们研究发现，肌腱组织中存在的一群具有多向分化潜能的肌腱干细胞(tendon derived stem cells, TDSCs)，在维持肌腱稳态以及损伤修复过程中起到重要的作用[3]。成脂分化潜能为干细胞的分化特性之一，而DM对TDSCs成脂分化潜能的影响尚未阐明。本研究我们通过构建DM SD大鼠模型，探究DM大鼠髌腱来源TDSCs的体外成脂分化潜能变化，以探讨DM对TDSCs成脂分化特性的影响，为进一步研究其分子生物学机制提供细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料和仪器

1.1.1 动物 健康雌性成年SD大鼠(8周龄，200～250 g，SPF级)6只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验期间SD大鼠在东南大学医学院动物实验中心饲养。所有动物实验在东南大学动物伦理委员会的批准下进行。

1.1.2 材料和仪器 罗氏血糖仪、血糖试纸和Ⅰ型胶原酶均为德国罗氏诊断公司(Roche Diagnostics GmbH)产品；LG-DMEM、体积分数0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、青霉素、链霉素均为美国Gibco公司产品；链脲佐菌素(STZ)、维生素C、地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤、吲哚美辛、胰岛素、油红O染液为美国Sigma公司产品；SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒和PCR引物为美国Invitrogen公司产品；First-Strand cDNA试剂盒为美国Thermo Scientific公司产品。

1.2 方法

1.2.1 建立DM大鼠模型 通过腹腔注射STZ溶液建立1型DM大鼠动物模型的方法已经在DM的实验研究中得到广泛的应用[4-5]。将SD大鼠随机分为DM组和对照组各3只。将STZ溶解于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.6)中，配置成10 mg·ml-1的STZ-柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并通过0.22 μm滤菌器去除细菌。DM组和对照组分别腹腔注射STZ-柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(65 mg·kg-1)和等体积的柠檬酸盐缓冲液(对照组)。造模3 d后测量并记录大鼠血糖(每3 d 1次)，DM组大鼠以血糖值持续高于250 mg·dl-1为造模成功。

1.2.2 大鼠TDSCs的分离培养 我们在之前的实验中已经建立了大鼠TDSCs的提取及培养方法[3,6]。在造模成功后两周，通过断颈法处死大鼠并测量体重，将大鼠浸泡于75%酒精中5 min，在无菌条件下取出髌腱，小心去除髌腱的肌腱-骨移行部分以及肌腱表面的腱膜后将其放入无菌的PBS缓冲液中。通过灭菌的眼科剪将髌腱组织剪碎放入无菌培养皿中，按照体积分数为0.3%加入Ⅰ型胶原酶溶液(3 g·L-1)消化2.5 h。通过70 μm滤器形成单细胞悬浮液后，以300×g离心5 min去除上清。用无菌PBS洗涤2次。将细胞沉淀用基础培养基(LG-DMEM、10%FBS、100 U·ml-1青霉素、100 mg·ml-1链霉素)重新悬浮后，以50个有核细胞·cm-2的密度接种到20 cm2的培养皿中，3 d后用无菌PBS洗涤两次后去除未贴壁细胞，7～10 d后用0.25%胰酶消化克隆样生长的细胞，并标记为原代细胞(P0)。在细胞生长浓度达到90%培养瓶底后传代细胞，取第3代(P3)细胞做后续实验。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

1.2.3 大鼠TDSCs成脂诱导分化实验 取P3的DM组TDSCs(dTDSCs)和对照组TDSCs(hTDSCs)，按4×10 cm3的细胞浓度接种于6孔板。在基础培养基下培养至细胞融合，然后将基础培养基更换为成脂分化诱导培养基(含500 μmol·L-1异丁基甲基黄嘌呤、500 nmol·L-1地塞米松、50 μmol·L-1吲哚美辛、10 mg·L-1胰岛素的基础培养基)。每3 d更换诱导液，培养至第9天时，将两组细胞分别行油红O染色检测脂滴形成情况，并作定量检测。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测成脂相关基因(C/EBP和PPARγ2)在mRNA水平的表达。

1.2.4 油红O染色及其定量检测 dTDSCs和hTDSCs成脂分化诱导后第9天时行染色，吸去培养液后用无菌PBS冲洗两遍；用10%的甲醛室温固定20 min后用60%的异丙醇轻柔冲洗两次，随后用0.3%油红O溶液每孔1 ml室温染色1 h，小心去除未结合染料，用双蒸水漂洗两遍后在倒置显微镜下观察并拍照。用异丙醇按照每孔1 ml孵育1 h后，取溶解充分的溶液用分光光度计在570 nm波长处读取吸光度值作油红O染色的定量检测[7]。

1.2.5 qRT-PCR检测成脂分化相关基因 将dTDSCs和hTDSCs成脂分化诱导第9天时，用无菌PBS冲洗两遍，用Rneasy试剂盒提取两组细胞的总RNA后根据First-Strand cDNA试剂盒逆转录为cDNA。C/EBPα和PPARγ2的引物序列见表1。参考SYBR Green qPCR试剂盒说明，使用ABI Stepone Plus上机，循环条件如下：95 ℃下变性10 min；95 ℃下20 s，最佳退火温度下30 s，72 ℃下30 s，循环45次；最后在60～95 ℃按照0.1 ℃·s-1加热速率进行加热测量溶解曲线。实验结果通过ABI Stepone Plus系统软件分析，靶基因以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，相关基因表达通过2-ΔCT公式计算。

1.2.6 统计学处理 所有统计结果以均值±标准差表示，采用SPSS 16.0软件进行数据分析。组间比较通过秩和检验，检验水准α=0.05，所有P值均表示双侧概率。

2 结 果

2.1 DM组与对照组血糖值及体重的变化

对照组大鼠接受柠檬酸盐腹腔注射后血糖值无明显变化，两周之内血糖均值为(75.08±1.67)mg·dl-1；DM组大鼠予STZ 65 mg·kg-1腹腔注射后第3天起血糖值均高于250 mg·dl-1，两周之内血糖均值为(426.53±9.51)mg·dl-1，显著高于对照组(P<0.001)，提示DM模型建造成功。在造模前对照组和DM组大鼠体重分别为(239.33±3.51)g和(239.67±2.52)g，差异无统计学意义；而造模后到处死取材前，DM组大鼠体重为(219.67±1.53)g，较对照组的(255.67±3.06)g显著降低(P=0.02)。

表1qRT-PCR中使用的引物序列及退火温度

Tab1ThesequencesandannealingtemperatureofthetargetgenesinqRT-PCRassay

基因 引物序列产物长度/bp退火温度/℃GAPDH5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'(正向) 5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'(反向)14860PPARγ25'-CGGCGATCTTGACAGGAAAG-3'(正向) 5'-GCTTCCACGGATCGAAACTG-3'(反向) 17459C/EBP5'-AAGGCCAAGAAGTCGGTGGA-3'(正向) 5'-CAGTTCGCGGCTCAGCTGTT-3'(反向)18955

2.2 两组大鼠TDSCs的形态学观察

按照我们之前研究中提取TDSCs的方法[3]，以50个·cm2接种培养后，两组细胞均为克隆样生长，传代培养至P3时：对照组hTDSCs的形态保持相对均一，呈现典型的细长纺锤型(图1A)；而DM组dTDSCs镜下表现为多突的纺锤型，细胞核相对较大(图1B)。

图1大鼠髌腱来源肌腱干细胞的形态学观察×100
A. hTDSCs呈现典型的长梭形，形态均一；B. dTDSCs细胞核较大，主要表现为多突的纺锤形

Fig1ThemorphologyoftheTDSCsfrombothgroups(×100)

2.3 TDSCs成脂诱导分化油红O染色结果

hTDSCs在成脂诱导9 d后，低倍镜下大部分细胞有大量的被油红O染色的脂滴形成(图2A)，高倍镜下hTDSCs细胞形态逐渐变圆，形成的脂滴分布在细胞核周围胞质内(图2B)；而dTDSCs在相同诱导条件作用下，低倍镜下仅有少量的dTDSCs有脂滴形成(图2C)，高倍镜下细胞也存在微小的圆形样改变，胞质内有少量的脂滴形成(图2D)。定量结果显示，与对照组相比，DM组在570 nm处吸光度值显著下降(P<0.001，图2E)。

2.4 TDSCs成脂诱导分化相关基因的表达

qRT-PCR比较成脂分化特异性基因的表达显示，dTDSCs的PPARγ2、C/EBP mRNA表达水平均显著低于hTDSCs，差异有统计学意义(P=0.01)，见图3A、B。

3 讨 论

随着越来越多的临床研究提示DM与肌腱病变之间存在一定的联系，DM肌腱病变的研究也越来越受到临床医生和研究人员的关注[2]。STZ作为一种胰岛B细胞毒性药物，在很多研究中用来构建1型DM动物模型[4-5,8]。本实验中，我们通过一次性腹腔注射STZ-柠檬酸盐缓冲液成功建造了DM大鼠模型，DM组SD大鼠机体处于持续的高血糖状态。而且DM大鼠的体重在造模两周后较对照组显著降低，而体重减轻也是1型糖尿病的特征之一[9]。

图2两组TDSCs成脂分化9d后油红O染色结果A、C×100；B、D×400低倍镜下hTDSCs(A)较dTDSCs(C)有更多的红色脂滴形成； 高倍镜下hTDSCs(B)成脂分化的细胞形态变圆，胞质内可见大量的红色脂滴，而dTDSCs(D)胞质内仅见少量的红色脂滴形成； E. 定量分析油红O染色结果，dTDSCs与hTDSCs比较，P<0.001

Fig2Theresultsoftheadiopgeicdifferentiationfor9daysofbothhTDSCsanddTDSCs

图3两组TDSCs成脂分化基因的mRNA表达情况
A. dTDSCs的PPARγ2 mRNA表达水平与hTDSCs比较，P=0.01； B. dTDSCs的C/EBP mRNA表达水平与hTDSCs比较，P=0.01

Fig3TheresultsoftheexpressionofadipogenicdifferentiationgenesatmRNAlevel

我们在既往的实验中已经成功建立了从髌腱中分离培养TDSCs的方法[3]。本实验中，我们按照此方法在模型建成两周后，分别从DM组和对照组中提取dTDSCs和hTDSCs进行成脂分化潜能的比较研究。

在体外成脂分化9 d后，在显微镜下发现hTDSCs和dTDSCs细胞周围均有透亮的脂滴形成，油红O染色显示两种TDSCs均能成脂细胞分化。hTDSCs胞质内有大量的红色脂滴，而dTDSCs胞质红色脂滴显著少于hTDSC；qRT-PCR结果提示dTDSCs的PPARγ2、C/EBP mRNA水平较hTDSCs显著降低。研究表明，PPARγ2和C/EBP对干细胞成脂分化过程中在转录水平起到重要的调控作用，其他脂肪细胞标志性基因如GLUT4、OB和SCD1等在其转录调控区域内含有功能性的PPARγ2和C/EBP的结合位点[10]。这提示在体外相同的条件下诱导dTDSCs和hTDSCs，DM肌腱干细胞成脂分化潜能显著降低。这些结果和Nadler等[11]的报道一致，他们通过DNA测序发现DM小鼠成脂相关基因的表达降低。

然而引起DM TDSCs成脂分化能力降低的分子生物学机制尚不清楚。我们在既往的研究中也发现，体外高糖环境可以抑制肌腱干细胞的增殖、促进凋亡并导致其成肌腱分化能力降低[12]。目前的研究显示,胰岛素是一种高效的促进脂肪形成因子，它能引起脂肪前体细胞内调控成脂分化转录因子的表达，从而促进脂肪前体细胞成脂肪细胞样分化[13]。Lehner等[14]的报道中指出，正常的肌腱中也存在着一类能够分泌胰岛素的肌腱细胞，这些细胞同时表达干/祖细胞标志物nestin、scleraxis以及胰高血糖素和胰岛素，因而这些细胞可能为TDSCs，提示TDSCs在机体内也有可能通过分泌胰岛素从而调节局部组织内的血糖水平；而STZ引起DM大鼠胰岛B细胞广泛破坏，体内由胰岛B细胞产生的胰岛素显著降低引起DM大鼠体内持续的高血糖，从而肌腱内局部升高的血糖水平刺激肌腱干细胞产生胰岛素，反馈性调控局部血糖。因此我们推测胰岛素及其相关因子可能是导致DM TDSCs成脂分化能力降低的关键因子，这些有待后续实验进一步深入研究。

综上所述，与正常的SD大鼠髌腱来源的TDSCs相比，STZ诱导的DM大鼠髌腱来源的TDSCs成脂分化能力显著下降，本实验结果为进一步揭示DM肌腱病变过程中持续体内高糖环境对TDSCs成脂分化功能影响的潜在分子机制提供了细胞生物学依据。

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