小柴胡汤对过氧化氢诱导的人皮肤成纤维细胞氧化应激损伤的保护作用

王春宇，姜 民，侯冠宇，侯吉光*

(1.吉林大学第二医院，吉林 长春130041；2.吉林大学公共卫生学院，吉林 长春130021；3.延边大学，吉林 延吉133000)

氧化应激指机体内活性氧产生和清除失衡、抗氧化能力降低、自由基产生增多一种状态，过度的氧化应激会导致DNA氧化损伤、蛋白质表达异常、组织损伤，是衰老和很多疾病的主要诱因[1]。衰老自由基学说认为机体自由基累积引发的氧化应激损伤是皮肤衰老中发挥重要作用，活性氧诱导胞内p53等衰老相关蛋白的表达，是人类美容的主要挑战之一[2]。

小柴胡汤是我国传统中药，在整个东亚已有数百年的应用历史，长期以来一直作为抗感染药物应用。近些年来，对小柴胡汤的研究不断深入，其抗炎[3]、免疫调节[4]、抗癌[5]、抑制变态反应[6]等药理作用已见报道。其抗氧化损伤和延缓皮肤衰老的作用也引起研究人员的关注，但其详细机制并未见报道。成纤维细胞是皮肤真皮的主要组成成分，在皮肤老化中担当重要角色[7]。本研究采用过氧化氢(H2O2)作为氧化剂诱导人皮肤成纤维细胞(Humandermal fibroblast cell，HDF)损伤，观察小柴胡汤水煎液对氧化损伤的HDF的保护作用，探究其保护机制，为小柴胡汤防止皮肤老化提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源

人皮肤成纤维细胞株(HDF)购自中科院上海细胞库，由本室保藏。

1.2 试验药物与试剂

柴胡、黄芩、人参、半夏、甘草、生姜、大枣由吉大二院门诊部门提供；DMEM培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自北京索莱宝生物科技公司；脂质过氧化产物(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)检测试剂盒购自南京建成生物科技公司；细胞内活性氧reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；Bcl-2、Bax、NF-kB、p53一抗购自美国Abcam公司；羊抗鼠、羊抗兔二抗购自美国Thermo公司。

1.3 实验仪器

CO2细胞培养箱(SANYO，日本)；倒置显微镜(Olympus ，日本)；ACCULAB电子天平(Sartorius，德国)；MTX-150型低温高速离心机(Sartorius，德国)；全自动酶标读数仪(KCjunior，美国)；Mini-PROTEAN 3 垂直电泳系统(Bio-Rad，美国)；凝胶成像分析系统(Bio-Rad，美国)。

1.4 细胞培养

冻存的HDF细胞自液氮罐中取出,于37℃水浴锅中快速复苏，培养于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基中，气体环境为37℃、5% CO2和100%饱和湿度的CO2培养箱。毎天均使用倒置显微镜观察细胞，记录细胞数量和状态等指标。当细胞融合达到80%以上，用胰蛋白酶消化，按1∶2的比例传代。

1.5 HDF细胞H2O2损伤模型的建立和小柴胡汤水煎液保护实验

取对数生长期的HDF细胞，每皿3×105个接种于6 cm的细胞培养培养皿中，或每孔6×103个接种于96孔细胞培养板中，于37℃、5% CO2和100%饱和湿度的CO2培养箱中孵育24 h。随后更换为含不同浓度(0、5、50、100、200、500 μmol/L)H2O2的DMEM培养基溶液培养4 h，实验重复三次，通过细胞活力分析选择合适的H2O2浓度。

小柴胡汤配伍后加10倍量水浸泡10 h，煎煮2 h后过滤，再加10倍量水煎煮2 h，合并两次滤液，浓缩至50 mg/ml备用。小柴胡汤水煎液保护实验中HDF细胞在DMEM培养基中孵育24 h，随后在含不同浓度(20、50、100 μg/mL)小柴胡汤水煎液的DMEM培养基中培养24 h，最后更换为含H2O2的DMEM培养基溶液培养4 h。同时设置H2O2模型组(不加药物)；空白对照组(不加药物和H2O2)，实验重复3次。

1.6 细胞活力的测定

96孔细胞培养板中的HDF细胞每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4 h，之后弃去培养基，加入200 μl DMSO，震荡15 min，酶标仪测定490 nm处吸收值。

1.7 MDA、SOD及ROS的测定

胰蛋白酶消化收集6 cm细胞培养皿中的HDF细胞，严格按照试剂盒上说明书操作，使用酶标仪测定MDA、 SOD及ROS含量。

1.8 蛋白质印迹实验

胰蛋白酶消化收集6 cm细胞培养皿中的HDF细胞，加入100 μl冰预冷的蛋白裂解液，冰上孵育60 min，孵育期间每隔10 min超声一次，使得蛋白得以充分裂解，低温高速离心机4℃ ,15 000 r×30 min离心收集上清液，于-70℃中保存。使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标蛋白，上样量为20 μg。将分离后蛋白条带转移至硝酸纤维膜，室温条件下的封闭液中孵育30 min，随后与一抗室温孵育60 min，洗膜后与二抗孵育60 min。使用ECL 化学发光法检测标记结合信号，用 Gel-Pro 凝胶成像系统灰度扫描电泳条带， QuantityOne软件分析各条带光密度值，系统自动生成结果。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 HDF细胞的H2O2氧化损伤模型的建立

如表1所示：H2O2浓度小于50 μmol/L时对HDF细胞存活影响较小，50 μmol/LH2O2组细胞存活率达87.9%；随着H2O2浓度增高，细胞存活率逐渐降低。其中200 μmol/LH2O2组细胞存活率为25.3%；当浓度增加至500 μmol/LH2O2时大部分细胞死亡。因此选择200 μmol/LH2O2作为模型的损伤浓度。

表1 不同浓度H2O2对HDF细胞活力的影响

注：与0 μmol/L H2O2组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.2 小柴胡汤水煎液对HDF细胞增殖能力的影响

如表2所示：小柴胡汤水煎液保护组相对于H2O2模型组细胞存活率均明显提高，且随着小柴胡汤水煎液浓度的提高，细胞存活率逐渐提高，其中100 μg/mL保护组细胞存活率高达84.1%，相对于H2O2模型组差异有统计学意义(P<0.01)，表明小柴胡汤水煎液保护能明显降低H2O2诱导的氧化应激损伤。

表2 不同浓度小柴胡汤水煎液对HDF细胞活力的影响

注：与空白对照组相比，##表示P<0.05；与H2O2模型组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.3 小柴胡汤水煎液对HDF细胞MDA 、SOD及ROS含量的影响

如表3所示：与空白对照组相比，H2O2模型组SOD含量显著降低(P<0.01)，而MDA含量和ROS荧光强度显著升高(P<0.01)。当添加不同浓度的小柴胡汤水煎液保护后，HDF细胞MDA、SOD及ROS含量均有回复；其中100 μg/mL保护组相对于H2O2模型组SOD含量显著升高(P<0.01)，MDA含量和ROS荧光强度显著降低(P<0.01)，表明小柴胡汤水煎液保护能显著降低胞内过氧化程度。

表3 不同浓度小柴胡汤水煎液对HDF细胞MDA、SOD及ROS含量的影响

注：与空白对照组相比，##表示P<0.05；与H2O2模型组相比，**表示P<0.01，*表示P<0.05。

2.4 小柴胡汤水煎液HDF细胞NF-kB、p53、Bcl-2、Bax蛋白表达量的影响

如图1所示：与空白对照组相比，H2O2模型组NF-kB、p53、Bax表达均显著提高(P<0.05)，而Bcl-2表达却显著降低(P<0.01)。而100 μg/mL小柴胡汤水煎液保护组相对于H2O2模型组NF-kB、p53、Bax表达均显著降低(P<0.01)，而Bcl-2表达却显著升高(P<0.01)。

3 讨论

小柴胡汤是我国著名的和解少阳剂，功可疏利三焦、调达上下、宣通内外、和畅气机、扶正祛邪、调整脏腑功能，可疏肝、调脾、和胃、气血兼治。近些年来，对小柴胡汤的研究不断深入，其应用范围不断扩展。陈军[7]等评价了小柴胡汤体外抗氧化能力，发现小柴胡汤对O2-、·OH、DPPH三种自由基的清除作用有明显的量效相关性，可能在抗皮肤衰老中发挥重要作用。日本学者在小鼠慢性胰腺炎模型中发现小柴胡汤在胰腺组织中具有明显的抗炎症、抗纤维化、抗氧化、抗凋亡作用[8]，并在随后的体外实验中验证小柴胡汤降低胞内自由基含量，上调p53等衰老相关蛋白表达[9]。

注：1为空白对照组，2为H2O2模型组，3为100 μg/mL 小柴胡汤水煎液保护组

图1不同浓度小柴胡汤水煎液对HDF细胞Bcl-2、Bax、NF-kB、p53表达的影响

过度的氧化应激会破坏DNA和蛋白质结构，导致生物膜和细胞核的损伤，引发细胞凋亡，是衰老的主要成因之一。成纤维细胞是皮肤真皮的主要组成成分，富含胶原蛋白，Bayreuther表型实验表明成纤维细胞的凋亡和生长抑制是皮肤老化的原因之一[10]。本研究采用H2O2诱导HDF细胞内自由基堆积，制备细胞氧化应激损伤模型，发现H2O2浓度与细胞存活率呈反比，表明H2O2浓度与细胞损伤程度相关，这与文献报道[11]一致，并选择200μmol/LH2O2作为模型的损伤浓度。而小柴胡汤水煎液的干预能明显提高受H2O2氧化应激损伤的HDF细胞的存活率，提示小柴胡汤对诱导的H2O2细胞凋亡有保护作用。

H2O2进入HDF细胞后，会通过多种代谢途径在胞内产生氧自由基，本研究中H2O2损伤导致胞内ROS含量升高，而小柴胡汤水煎液的干预降低了胞内ROS含量。MDA是自由基攻击生物膜不饱和脂的主要产物，反映氧自由基对生物膜的损伤大小，SOD是重要的氧自由基清除酶，反映机体对自由基的清除能力，两者是氧自由基代谢的主要指标，间接反映了细胞过氧化程度。本研究中H2O2损伤导致胞内SOD活性降低，MDA生成增加，表明H2O2引发HDF细胞过氧化，导致细胞损伤；小柴胡汤水煎液的干预能明显提高胞内SOD活性，降低MDA生成，其中100 μg/mL保护组与空白对照组指标最接近，提示小柴胡汤对H2O2造成的HDF细胞氧化损伤有保护作用。

ROS能激活NF-kB表达，在H2O2氧化损伤的HDF细胞中NF-kB表达增加，并激活典型的衰老蛋白p53的表达[12]。Bcl-2和Bax是p53的下游靶基因，Wood[13]等报道Bcl-2能通过抑制氧化反应通路增强小鼠成纤维细胞NIH-3T3的抗氧化能力，而Bcl-2/Bax比率的提高能够抑制H2O2引起的NIH-3T3细胞凋亡，对细胞起到保护作用。本研究发现H2O2氧化损伤的HDF细胞中NF-kB表达上调，柴胡汤水煎液的干预能降低NF-kB的表达，引发衰老蛋白p53表达下调，进而升高Bcl-2/ Bax比率，对HDF细胞氧化损伤起到保护作用。

皮肤衰老是人类美容的天敌，降低表皮细胞氧自由基生成，减少其氧化损伤是延缓皮肤衰老的有效方法之一。本研究表明小柴胡汤对H2O2诱导的人类成纤维细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用，小柴胡汤的主要药理作用是降低胞内ROS产生，提高细胞抗氧化能力，其机制在于降低NF-kB表达，导致p53表达下调与Bcl-2/ Bax比率升高。

参考文献：

[1]刘俊法,郝亚逢,李 杨.九龙藤总黄酮对过氧化氢诱导乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护作用[J].国际中医中药杂志,2015,37(9):803.

[2]Rai P,Onder T T,Young J J,et al.Continuous elimination of oxidized nucleotides is necessary to prevent rapid onset of cellular senescence[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(1):169.

[3]申晓伟,徐 慧,张华敏.曹洪欣教授运用小柴胡汤临床应用举隅[J].国际中医中药杂志,2014,36(1):70.

[4]李 江,谢 鸣,甘 媛.小柴胡汤及其药群配伍抗小鼠 H22 肝肿瘤及免疫调节作用[J].中国中药杂志,2008,33(9):1039.

[5]林子洪,廖威明,傅 明,等.莪莲小柴胡汤的抗癌作用及其机制研究[J].中国病理生理杂志,2008,24(9):1741.

[6]丁世永,郑平东,何立群,等.小柴胡汤改善慢性肾小球肾炎患者炎症及减轻蛋白尿的作用研究[J].中国中西医结合杂志,2013,33(1):21.

[7]陈 军,周密思,黄 海,等.小柴胡汤抗氧化延缓皮肤衰老功效的体外实验研究[J].时珍国医国药,2013,24(12):2889.

[8]Motoo Y,Xie MJ,Su SB,Sawabu N.Molecular mechanismsof therapeutic effects of Saikokeishito on spontaneouschronic pancreatitis in the WBN/Kob rat[J].J Tradit Med，2003，20(4):143.

[9]Takata T,Motoo Y,Tomosugi N.Effect of Saikokeishito,a Kampo medicine,on hydrogen peroxide-induced premature senescence of normal human dermal fibroblasts[J].Journal of integrative medicine,2014,12(6):495.

[10]张 聚,刘斯奇,徐宁志.细胞老化的基本特征和研究进展[J].中国细胞生物学学报,2013,1:2.

[11]杜先华,李海燕,王 爽,等.H2O2诱导体外培养的皮肤成纤维细胞氧化应激损伤[J].中国老年学杂志,2011,31(4):644.

[12]Adhikary A,Mohanty S,Lahiry L,et al.Theaflavins retard human breast cancer cell migration by inhibiting NF-κB via p53-ROS cross-talk[J].FEBS letters,2010,584(1):7.

[13]Wood W G,Igbavboa U,Muller W E,et al.Statins,Bcl-2,and apoptosis:cell death or cell protection?[J].Molecular neurobiology,2013,48(2):308.