山莨菪碱联合普罗布考对糖尿病大鼠造影剂肾损伤凋亡基因FAS/FASL表达的影响

戈立秀，赵 凯，高巧营，高 晟，李景照，李永健，常艳敏

(1.天津市南开医院 检验科，天津300100；2.天津市南开医院 心血管内科；3.天津市南开医院 中西医结合急腹症研究所)

随着经皮冠状动脉介入技术(percutaneous coronary intervention,PCI)在临床中的广泛应用，因造影剂导致的造影剂肾病(contrast-induced nephropathy,CIN) 日益增加。CIN已成为了院内获得性急性肾损伤的重要原因之一[1,2]。研究发现接受冠脉造影介入治疗的患者中CIN发病率为8.7%[3]。当患者伴有慢性肾病、糖尿病或高血压等基础疾病时，使用高渗造影剂可使CIN发生率高达25%[4]。目前大多学者认为肾血管收缩诱导的肾小管缺氧性损伤以及造影剂直接对肾小管细胞的杀伤作用是导致CIN的主要机制[5]。造影剂可诱导肾脏细胞的凋亡，细胞凋亡参与肾脏多种疾病的发生、发展及修复过程。在调控细胞凋亡的诸多因素中FAS及其配体FASL是最具有代表性[6]。

近年来医务工作者一直在寻找有效、简便的CIN预防措施[7]。研究者发现普罗布考和山莨菪碱在治疗肾脏疾病中具有保护肾组织的作用[8,9]。但目前关于山莨菪碱联合普罗布考对CIN治疗的相关研究尚不多见。本研究通过建立CIN大鼠模型，检测药物干预前后大鼠肾脏细胞凋亡基因FAS、FASL及其蛋白的表达水平，探讨上述药物对CIN的预防机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂45只健康雄性SD大鼠，体重240-260 g，由军事医学科学院环境所动物中心提供，清洁级标准饲养(许可证号SCXK(军)2009-003)；链脲佐菌素(美国Sigma公司)；复方泛影葡胺注射液(购于湖南汉森制药股份有限公司)；FAS和FASL单克隆抗体(美国CST公司提供)；NGAL和IL-18检测试剂盒(上海蓝基生物有限公司)；KIM-1检测试剂盒(美国R&D公司)；动物组织RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.2糖尿病大鼠模型建立及分组SD大鼠适应性喂养一周，造模前检测大鼠尾静脉血糖，均显示在正常范围。所有大鼠以腹腔单剂量注射链脲佐菌素60 mg/kg建立糖尿病模型，注射后72 h及7天后检测大鼠血糖，以非禁食血糖>16.7 mmol/L判定糖尿病大鼠模型成功与否。将糖尿病模型大鼠随机分为对照组(N组)、造影剂肾病组(M组)、山莨菪碱组(A组)、普罗布考组(P组)、山莨菪碱联合普罗布考组(A+P组)，每组9只。

1.3CIN模型建立及取材根据焦占全[10]和贾辛未[11]CIN 造模及用药方法，结合山莨菪碱及普罗布考药代动力学特点，大鼠饲养9w后，P组及A+P组大鼠给予普罗布考(500 mg/kg)灌胃，N组和M组以等量生理盐水灌饲，连续6 d，第7天禁水不禁食。7 d后，麻醉状态下，注射泛影葡胺前15 min，A组、A+P组分别给予山莨菪碱100 μg/100 g腹腔注射，N组、M组、P组则给予等量生理盐水腹腔注射。A组、A+P组于注射造影剂后4 h内每小时腹腔注射山莨菪碱(100 μg/100 g)1次，至第4-12 h每4 h重复腹腔注射山莨菪碱，N组、M组、P组则于相应时间腹腔注射等量生理盐水。以血清Scr值高于基础值的25%判定CIN的模型是否成功。

于注射造影剂前、注射后24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，开腹采集下腔静脉血2 ml，迅速取下双肾称重，留取肾组织。

1.4肾功能及损伤指标检测脲酶法测定血清尿素氮(BUN)；苦味酸法测定血清肌酐(Scr)；ELISA法检测尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤因子-1(KIM-1)、白介素18(IL-18)。

1.5FAS和FASL基因mRNA检测参照试剂盒说明提取各组大鼠肾组织总RNA及逆转录。FAS、FASL和β-actin引物均由上海生工生物技术有限公司合成，见表1。应用IQ5型荧光定量PCR仪进行定量检测，结果参照2-△△Ct法[12]进行分析。

表1 各基因引物序列

1.6FAS和FASL蛋白检测参照提取试剂盒说明提取大鼠肾组织总蛋白，热变性处理后经10%的SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭3 h。FAS和FASL单克隆抗体4℃孵育过夜，二抗孵育2 h后化学发光法发光成像。以β-actin为内参照。

1.7肾脏组织病理检测肾脏组织经10%甲醛固定后，进行常规脱水石蜡包埋，切片，进行HE染色，于正置显微镜下观察肾脏组织病理变化。

2 结果

2.1各组大鼠造影24h后肾脏功能指标变化情况与N组比较，M 组大鼠BUN、Scr、肾指数、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明显升高。与M组比较，A组Scr、肾指数含量明显降低，而BUN、NAGL、KIM-1、IL-18均无明显变化；P组BUN、Scr、肾指数、NAGL、IL-18含量均明显降低，而KIM-1无明显变化；A+P组BUN、Scr、肾指数、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明显降低。与A组比较，A+P组BUN、Scr、肾指数、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明显降低。与P组比较，A+P组BUN、Scr、KIM-1含量均明显降低，肾指数、NAGL、IL-18均无明显变化。见表2。

表2 给予药物干预后大鼠肾脏功能各指标的变化情况

注：与N组比较，a)P<0.05；与M组比较，b)P<0.05；与A组比较，c)P<0.05；与P组比较，d)P<0.05

2.2肾脏FAS、FASL基因表达水平与N比较，M组的FAS和FASL基因水平均明显升高；与M比较，A组和P组只有FASL基因水平降低，而A+P组FAS、FASL基因水平均有很大程度的下降；与A组比较，A+P组大鼠FAS、FASL基因表达水平均明显降低；与P组比较，A+P组大鼠FAS表达水平有所降低，FASL表达水平无变化。见表3。

2.3肾脏FAS、FASL蛋白表达水平Western Blotting结果显示(见图1)，M组大鼠肾脏组织中FAS和FASL蛋白表达量明显高于N组；A组、P组只有FASL表达量低于M组，而A+P组大鼠肾脏的FAS和FASL蛋白表达水平均低于M组。

表3 给予药物干预后各组大鼠FAS、FASL基因表达变化

注：与N组比较，a)P<0.05；与M组比较，b)P<0.05；与A组比较，c)P<0.05；与P组比较，d)P<0.05

1.N组；2.M组；3.A组；4.P组；5.A+P组

2.4肾脏病理改变各组大鼠肾组织的HE染色结果(见图2)， N组大鼠肾小球、肾小管及间质未见病变。M组大鼠肾小体有的呈分叶状，肾小管上皮细胞可见空泡样变性、局部坏死；A组和P组大鼠肾脏的病理变化基本同M组，A+P组病变稍有好转。

图2 各组大鼠肾脏病理变化(HE染色，×200)

3 讨论

近年来随着心脏介入诊疗技术的发展，造影剂被广泛应用于临床，由其诱导的CIN也逐渐被人们认识。但CIN 的发病机制尚不十分明确。研究发现[1,13]，造影剂能直接损伤糖尿病大鼠肾小管，诱导小管上皮细胞凋亡；可促进氧自由基、炎症因子等产生，参与细胞凋亡，可导致糖尿病大鼠发生肾损伤，导致肾脏形态及功能异常。本研究采用糖尿病大鼠经尾静脉注射复方泛影葡胺造影剂构建CIN模型,发现造影剂肾病组大鼠体重增加缓慢或减轻；大鼠肾脏明显增大，肾指数明显高于对照组(表2)；大鼠BUN、Scr水平明显高于对照组；且大鼠肾小体呈分叶状，肾小管上皮细胞可见空泡样变性、局部坏死(肾脏病理HE染色)。目前常规的Scr、BUN等指标的变化滞后于肾损伤的发生，并不能及时反映肾功能状态。一些早期生物学标记物，如NGAL、IL-18、KIM-1等用于反映肾脏损伤的早期诊断[14,15]。本研究检测了上述三个指标，结果显示造影剂肾病组大鼠尿NGAL、KIM-1及IL-18的水平均高于对照组。由上可见造影剂肾病组大鼠已出现肾脏损伤表现。

山莨菪碱已被广泛用于治疗糖尿病肾病，对肾功能具有良好保护作用。普罗布考的抗氧化性能可以抑制氧化的低密度脂蛋白胆固醇的形成，对于因动脉粥样硬化导致的急性冠脉综合征有较好的治疗效果。急性冠状动脉综合征术后可影响肾功能改变[16]。赵凯等[8]发现，对接受经皮冠状动脉介入治疗的不稳定型心绞痛老年患者预防性应用普罗布考可有效减少CIN的发生。本研究中造影剂肾病组大鼠给予山莨菪碱、普罗布考及联合药物干预后，与造影剂肾病组相比，山莨菪碱组除Scr、肾指数明显降低外，其他如BUN、NAGL、KIM-1、IL-18均无明显变化，普罗布考组BUN、Scr、肾指数、NAGL、IL-18含量均明显降低，只有KIM-1无明显变化，联合组BUN、Scr、肾指数、NAGL、KIM-1、IL-18含量均明显降低，由此推测普罗布考在改变CIN大鼠肾功能方面优于山莨菪碱，而两药联合使用效果更佳。

目前CIN的发病机制尚不明确。造影剂可直接损伤肾小管和促进氧自由基、炎症因子等产生，诱导肾组织细胞凋亡。细胞凋亡受多种因素调控，其中受体介导凋亡途径中最具代表性的为FAS/FASL系统，它是诱发肾脏多种细胞凋亡的重要蛋白。FAS属于TNF细胞因子超家族，当肾组织上的FASL与靶细胞的FAS结合后，对肾小球和间质细胞产生细胞毒作用[17]。山莨菪碱是我国首先从茄科植物唐古特山莨菪中提取的一种生物碱，属 M-胆碱能受体阻断剂。研究证实，山莨菪碱具有解除微血管痉挛和改善微循环的作用，进而改变肾功能[18]。普罗布考是目前已知最强的断链抗氧化剂，其分子内所含的酚羟基很容易被氧化而发生断链，捕捉氧离子并与之结合后形成稳定的酚氧基，有效降低血浆氧自由基水平，具有明显的抗氧化、抗细胞凋亡的作用[19]。本研究中，造影剂肾病组大鼠肾脏FAS和FASL的表达升高，由此可见造影剂肾病组大鼠肾脏凋亡细胞增加。给予山莨菪碱和普罗布考后，大鼠FASL基因有不同程度的降低，说明山莨菪碱和普罗布考单独用药可抑制调亡基因FASL；给予联合药物干预后的大鼠FAS和FASL基因表达低于山莨菪组和普罗布考组，可见联合用药下调大鼠凋亡基因FAS和FASL的作用更强。故而推测CIN模型大鼠给山莨菪碱、普罗布考及联合药物干预后，在一定程度上均可下调FAS/FASL表达，减少肾脏细胞的凋亡，且普罗布考和山莨菪碱联合具有协同作用。

综上，山莨菪碱、普罗布考及两者联合使用均可下调FAS/FASL的表达，减少肾细胞凋亡，减轻肾损伤。两药联合在抑制肾细胞凋亡方面具有协同作用。

作者简介：戈立秀(1983-)，女，硕士，主管技师，临床医师。主要从事心血管疾病的实验室检测研究。

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