血浆中miR-21的表达在原发性脑淋巴瘤临床诊断中的意义

王先伟，陈 东，李召磊

(大连市中心医院 神经外三科，辽宁 大连116033)

微小RNA(miRNA)是内源性非编码的小分子RNA的一个种类，大约只有18-25 个bp的长度。在动物基因组中，它大多以单拷贝、多拷贝或基因簇等形式广泛存在着。它虽然只是占人类基因组的约1%的内容，但是人类将近三成的基因却受其调节。它不但可作为癌基因存在，也可以作为抑癌基因而起到作用。在Mitchell等人[1]的研究中已证明外周血血浆中存在稳定的miRNA。miR-21是一种广泛存在于人类组织细胞中的，而且被发现较早的一类微小RNA。越来越多的研究发现miR-21在包括原发性脑淋巴瘤在内的多种实体肿瘤中均表达过高[2，3]，在疾病进展中极其可能发挥着癌基因的作用。在神经外科临床诊断中原发性脑淋巴瘤与脑胶质母细胞瘤鉴别起来十分困难，本研究通过检测原发性脑淋巴瘤患者、脑胶质母细胞瘤患者血浆中miR-21的表达，探讨其作为原发性脑淋巴瘤淋巴瘤特异性标志物对诊断、疗效及预后评价的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂，DL1000 DNA Ladder 均购自大连宝生物试剂公司。TRIzol 试剂购于美国 Invitrogen 公司，逆转录试剂盒及2×Tap PCR MasterMix购于天根生化科技有限公司，引物由上海英俊生物技术有限公司设计合成。PCR 仪购于 ABI 公司。

1.2 病例分组

大连市中心医院神经外科 2015年7月-2017年7月收治的原发性脑淋巴瘤患者20 例，脑胶质母细胞瘤患者20例，男女比例约为1∶1，年龄 22-75岁(中位年龄 50 岁)，均经手术后组织病理学检查确诊。采血时间均为术前。

1.3 标本采集与预处理

采用抗凝管采集所有研究对象外周血5 ml，2000转离心12 min，将上层血浆转移至洁净EP管，再以15000 转离心12 min，吸取上层血浆于洁净 EP 管，-80℃冻存备用。

1.4 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

取1 ml血浆加入EP管中，75℃加热5 min，42℃温育 1 h 后利用TRIzol试剂进行样本中RNA 的提取与纯化，得到纯化后的血浆 RNA 样本。RNAiso后匀浆氯仿抽提，异丙醇沉淀。逆转录得cDNA。PCR反应体系：灭菌水 28.75 μl，5×PCR buffer 10 μl，上下游引物各0.5 μl，TaKaRa E×TaqHS 0.25 μl，cDNA 10 μl，共50 μl反应体系。PCR反应条件为：94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 50 s，72℃ 50 s，72℃ 10 min，35个循环。取5 μl RT-PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并摄图，电泳图像采用gel pro 4.5图像分析软件分析平均光密度值，以同一标本的目的基因与GAPDH平均光密度比值反应目的基因mRNA表达水平。

1.5 统计学处理

实验数据采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，结果用均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，所有统计均为双侧，显著性检验水准取α=0.05，以P<0.05代表有统计学差异。

2 结果

琼脂糖凝胶电泳可见条带为22 bp，有miR-21表达，与脑胶质母细胞瘤组相比，原发性脑淋巴瘤组miR-21表达明显升高(P<0.01)，两组间差异显著，具有统计学意义,见表1。

3 讨论

表1 两组miR-21表达水平比较(x±s)

注：两组相比，P<0.01

miR-21是一种非常重要的微小RNA，它在多种肿瘤细胞中的表达均出现显著异常，尤其是在淋巴系统肿瘤中意义非凡，这当然也包括原发性脑淋巴瘤。多种研究证实， miR-21具有重要的临床意义：它作为一种原癌微小RNA，与多种肿瘤的发生发展密切相关，可用于肿瘤的诊断、治疗和预后。然而由于现在人们对 miR-21的转录调控机制、靶基因以及其靶基因的作用机制缺乏更加深入的了解，从而无限限制了miR-21在临床上的应用。

原发性脑淋巴瘤原是临床上较为罕见的神经系统肿瘤，然而近年来其发病率及检出率逐渐上升。因为淋巴瘤对于放疗及化疗敏感，是可治愈的肿瘤，所以准确诊断脑淋巴瘤对本病的治疗效果至关重要。在神经外科临床诊断过程中，手术前的影像学诊断至关重要，而原发性脑淋巴瘤与脑胶质母细胞瘤在增强MRI上影像十分相似，往往二者需要通过术后的病理学来鉴别。这样一来给患者造成了手术创伤，甚至延误的病情，因为淋巴瘤可以通过放化疗明显改善。而通过本研究可以发现，若是在术前鉴别诊断困难时，进行外周血的miR-21监测，可以有效判断出是否为淋巴瘤，进而为诊断提供新思路，避免很多弊端。

本研究发现，血浆中miR-21的表达水平在原发性脑淋巴瘤患者组显著均高于脑胶质母细胞瘤组。目前已经有研究结果表明[4]：检测血浆中 miR-21的表达量对淋巴瘤的正确诊断率可达到85.7%。这提示，血浆中检测 miR-21的表达量有助于早期原发性脑淋巴瘤的诊断，对临床怀疑为原发性脑淋巴瘤患者，影像学与脑胶质母细胞瘤类似，而且患者无法开颅取病理，化验其血中miR-21的表达量可以帮助其早期诊断。

参考文献：

[1]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al．Circulating microRNAs as stable blood based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(30):10513.

[2]Selcuklu SD,Donoghue MT,Spillane C.miR-21 as a key regulator of oncogenic processes[J].Biochem Soc Trans,2009,37(4):918.

[3]张保贵，刘炳亚，燕 敏.miR-21与肿瘤的研究进展[J]．国际外科学杂志，2011，38(4)：262.

[4]葛甜甜，梁 勇，付 蓉,等.淋巴瘤患者血浆中MIR-21、MIR-155、MIR-210的表达及临床意义[J].中国实验血液学杂志，2012,20(2):305.