湿地植物燕子花(Iris laevigata)对模拟施氮的响应研究

曲文静，乔娅楠，王灵艳，包 宇，盛连喜，唐占辉

(1.东北师范大学环境学院，吉林 长春 130117； 2.东北师范大学国家环境保护湿地生态与植被恢复重点实验室，吉林 长春 130117；3.武警后勤学院学员二旅，天津 300309)

近年来，由于人类活动的影响，人为释放的氮素正在各种生态系统中不断累积，并对生态系统的结构和功能产生显著影响[1-3].外源氮输入的增加，造成了生态系统的一系列变化，包括土壤化学性质[4-5]、植物物种组成[6]、植物-土壤系统温室气体排放的变化[7-8]，以及凋落物分解[9-10]和生态系统的碳蓄积[11]的改变.氮素不仅是湿地土壤中的主要限制性养分，也是永久性淹水湿地发生富营养化的主要诱因之一[12].湿地土壤中氮素含量的变化及迁移转化过程，也大大影响了湿地生态系统的结构、功能和湿地的生产力[13-14]，对湿地植物的生长及群落组成具有重要影响[15]，而湿地植物也同时会采取不同的策略以适应氮素变化的湿地环境[16-17].

当植物生长受氮素限制时，适当氮素的增加能刺激植物生长，增加植物生产力、促进植物地上生物量的增加[18].当生态系统处于氮饱和状态时，即生态系统的氮超出植物生长所需之时，氮的输入可能就会抑制植物的生长、减少植物生产力，植物的生物量会随着氮输入量的增多而显著下降[19-20].植物的生理生化过程与环境中氮素含量也有很大关联[21]，特别是叶绿素与光合作用相关酶的合成[22-24]，以及丙二醛(MDA)、可溶性总糖和脯氨酸含量的变化等[25-26].此外，植物繁殖也可以对不同环境变化做出不同的响应[27-28].氮素的增加会引起植物物候的变化，尤其是植物花期[29-30]及繁殖策略方面[31-32]，如Cleland等[30]研究发现氮素添加可以使9个禾本科物种的花期推迟.

近年来，湿地氮素输入方面的研究主要集中于植物对氮的吸收作用[33]、氮输入对沼泽湿地温室气体的排放影响等方面[34-35]，而天然湿地氮输入对植物生长、生理特性及繁殖等方面的影响研究相对偏少.吉林省龙湾自然保护区分布有不同演替阶段的湿地，其中金川湿地是一典型的泥炭沼泽湿地，周围分布有大量农田，农业活动过程中，大量氮素可以随地表径流进入湿地，这将对该湿地生态系统的植物生长和群落演替造成潜在的影响.燕子花(Irislaevigata)是分布于金川湿地的一种鸢尾属植物，前期的调查研究表明，它的生长繁殖状态受湿地环境因子影响很大，相对比较敏感[36].鉴于其为该湿地一种对土壤养分极其敏感的植物物种，本研究选取氮添加这一控制方式，通过模拟控制实验研究了燕子花的形态、生理和繁殖对氮素的响应，以揭示氮素添加对燕子花的影响机制.研究结果对于湿地保护和湿地生态监测与评价具有一定的参考价值，对燕子花植物种群的保育具有重要的实践意义.

1 材料和方法

1.1 研究地点

研究地点位于吉林省通化市辉南县金川镇(126°23′07.52″E，42°20′57.47″N，海拔624 m)的东北师范大学龙湾湿地生态研究站，该区域属北温带大陆性季风气候，年平均气温4.1℃(1月平均气温-15.7℃，7月平均气温22.5℃)，年降水量704.2 mm，降水主要集中在7—8月份.

1.2 材料

研究材料为燕子花(IrislaevigataFisch.)，在龙湾自然保护区主要分布于湿地中，花期5—6月，果期7—8月，其他生物学基本属性详见文献[36-37].

1.3 控制实验方案

设置9个模拟控制单元槽(长、宽、高1.5 m×1 m×0.5 m)，原料为砖砌边墙、水泥衬里.槽内用燕子花自然分布区(金川泥炭沼泽湿地)的原生土壤填充(土壤总氮含量约为2 kg/m3)，填充厚度为0.3 m.将金川泥炭沼泽湿地自然生长的大小基本一致的燕子花植株移栽到人工控制槽内进行培育，使植株密度与自然生境基本一致(约30株/m2).植株移栽工作在2015年进行，移栽后的燕子花植株经过缓苗后自然生长并越冬，第二年春季进行控制实验.

共设置3个氮素添加处理(模拟施肥)：0(对照)，5 g/m2(低氮处理)，15 g/m2(高氮处理).氮素控制条件下的水位高度均保持0 水平(与野外自然生境大致相同)，每个处理分配3个单元槽.氮素来源为硝酸铵(NH4NO3)，研究期间间隔20 d分两次进行添加，方法是将固体NH4NO3溶解于5 L蒸馏水均匀喷洒到人工控制槽的土壤上.

1.3.1 燕子花的形态特征测定

新苗出现后，测定燕子花植株的高度和叶片数量随时间的变化情况(每个处理30株).在生长末期，收获每个处理条件下各30株标记植株的地上部分，在65℃的烘干箱内烘干48 h，测量植株地上生物量.

1.3.2 燕子花的生理指标测定

选择3个晴天，在同一时间段(9：00—10：00)分别选取各处理3株植物叶片的中间部位，利用CI-340 便携式光合作用测定仪进行净光合作用速率的测定.

于2016年9月初，将收割的燕子花植株在室内进行生理指标的测量：选取燕子花叶片的中间部位，将其剪碎，提取测定物，用丙酮法测定叶绿素含量[38]，硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量，蒽酮比色法测定可溶性糖含量，茚三酮比色法测定脯氨酸含量，3次重复.

1.3.3 燕子花的繁殖生物学特征测定

记录不同处理的燕子花始花日期、单花持续时间；并测量花的垂瓣长宽、旗瓣长宽、雌雄蕊高(精确到0.01 mm)，每个花部综合特征指标测量样本数为9.

采用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性[39]：将花的柱头取下放入凹面载玻片中，若柱头周围反应液成蓝色并有大量气泡产生表明柱头具有可授性.用“+”的个数表示观察到的柱头可授性情况，3次重复.

采用TTC法测定花粉活力[40]：将花粉囊中的花粉取出并进行染色，显微镜下统计未被染色花粉数和被染色花粉数，计算花粉活力.花粉活力=被染色花粉数/(被染色花粉数+未被染色花粉数)×100%，3次重复.

花粉数量的测定：将未散粉的花粉囊中的花药全部取出，置于1 mL的离心管中，充分挤碎，使花粉散布于离心管中，加蒸馏水定容至1 mL，充分摇匀后用移液枪取出100 μL，置于浮游生物计数框内，在显微镜下统计花粉数，再进行换算.最后用计数法测定花粉胚珠数(用解剖针小心挑破子房壁进行计数)，3次重复.

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0统计分析软件进行数据分析.先检验数据是否符合正态分布，对于服从正态分布的数据，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较不同处理之间数据的差异，并采用LSD法进行多重比较；对于不服从正态分布的数据，采用非参数检验中K-独立样本法比较多个处理间数据的差异，两组间比较用两独立样本非参数检验.显著性检验的显著度设置为P=0.05.统计数据用平均值±标准误差表示.用SigmaPlot 12.5软件作图.

2 结果

2.1 不同氮素添加处理下燕子花的形态响应

在控制氮素添加量的条件下，燕子花的株高随着氮素的添加呈现逐渐降低的趋势(见图1A).方差分析结果显示，不同的氮素添加量，燕子花的叶片数并不存在显著差异(P>0.05，见图1B)，说明氮素的添加对于燕子花叶片数的影响并不显著.燕子花生物量的分析结果与株高具有相同的变化趋势，随着氮素添加量的增加，燕子花生物量逐渐降低，对照组生物量(14.13±0.93) g显著高于低氮组(8.11±1.40) g和高氮组(5.77±0.44) g(P<0.05).

图1 不同氮素添加量对燕子花株高和叶片数的影响

2.2 不同氮素添加处理下燕子花的生理响应

不同氮素添加处理下，燕子花的各生理指标均出现显著差异.随着氮素添加量的增加，燕子花的净光合作用速率逐渐下降，对照组净光合速率(16.43±3.80) μmol/(m2·s)显著高于低氮组(13.68±1.16) μmol/(m2·s)和高氮组(10.64±1.14) μmol/(m2·s)(P<0.05).燕子花叶绿素含量与净光合作用速率的变化趋势保持一致，也随氮素添加量的增加逐渐降低(见图2A).燕子花叶绿素a的含量总体高于叶绿素b的含量，且两者与叶绿素总含量具有相同的变化趋势.而氮素的添加对燕子花丙二醛含量(见图2A)、可溶性糖含量以及脯氨酸含量(见图2B)的影响表现均一致，随着氮素添加量的增加呈现逐渐增加的趋势.

(同列不同字母代表处理间差异显著，下同)

2.3 不同氮素添加处理下燕子花的繁殖响应

图3 不同氮素添加量对燕子花花部综合特征的影响

不同氮素添加处理下，燕子花的开花物候有一定的差异，低氮组的开花日期相对于对照组推后了1 d，但开花持续时间均为3 d.开花数量低氮组(9朵)明显低于对照组(20朵)，高浓度氮的添加抑制了燕子花的开花，高氮组开花数量为0.氮素的添加对燕子花花部综合特征具有显著影响，各处理组花的垂瓣长、垂瓣宽、旗瓣长、旗瓣宽以及雌雄蕊长差异显著(P<0.05)，低氮组各指标的长度均显著低于对照组且各处理间差异均显著(P<0.05，见图3).虽然对照组的花粉数、花粉活力和柱头可授性高于低氮组，但是氮素的添加对于花粉数、胚珠数、花粉活力和柱头可授性的影响差异不显著(P>0.05，见表1).

表1 氮素添加量对燕子花花粉胚珠数、花粉活力和柱头可授性的影响

注：+柱头具有可授性；++柱头具有较强可授性.上标字母相同表示差异不显著(P>0.05).

3 讨论

湿地的养分状况直接决定了湿地植物的种类、数量和构成，养分的改变会直接引起湿地植被类型的改变[41].氮素是湿地生态系统中各种植物生长、发育以及繁殖所必需的营养元素之一，其含量的多少可以对湿地生态系统中的植被产生显著影响[42].有研究表明，在氮缺乏的生态系统中，氮的输入能刺激植物生长，提高生产力，但长期输入氮素可使植物生物量减小[43]；在氮饱和的生态系统，氮的输入会抑制植物的生长，甚至导致生态系统衰退[44].本实验结果表明，随着氮素添加量的增加，燕子花株高、生物量显著下降，反映了金川湿地原生的土壤中氮素并不缺乏，本实验的氮添加处理对燕子花植株的生长起到一定的抑制作用，燕子花通过改变其生长状况来适应氮元素的输入.由此可见，过量的氮素输入，将改变金川湿地的初级生产力，影响湿地生态系统的平衡与稳定.这与Bauer 等[45]的研究结果一致，他们发现在森林生态系统中，高氮输入(150 kg/(hm2·a))导致植物叶片和木材产量显著降低.

氮素不仅是植物生长所需的一种重要养分，也是植物合成生理代谢调控物质——酶的主要组分.氮素的施加会对植物的一系列生态生理指标产生显著影响.研究[46]表明，植物叶片中的叶绿素含量与其体内的含氮量密切相关，无论是在含氮量低的时候还是在含氮量过高的时候，植物都会降低叶片中的叶绿素含量，只有在适宜的含氮量情况下，叶绿素含量才能达到最高.张乐等[47]在研究不同浓度氮素对一串红(Salviasplendens)营养生长影响的实验中指出，叶绿素a和叶绿素b都是含氮化合物，而叶绿素是反应叶片功能和植株生长发育状况的重要指标，缺氮时叶片会失绿黄化.本实验的研究结果与此一致，氮的添加并没有促使燕子花叶绿素含量和净光合作用速率的提高反而出现降低趋势，并且高氮组的燕子花植株出现叶片黄化的现象.Nakaji等[48]和Yamaguchi等[49]的研究表明，在高氮水平下植物叶绿素含量的降低可能与叶片中营养失衡有关.丙二醛(MDA)为膜脂过氧化的主要产物之一，植物在逆境条件下丙二醛含量会随着胁迫强度的增加而升高，加速膜脂过氧化，植物细胞中丙二醛的变化大小预示着膜的受伤程度[50].本研究的结果表明，丙二醛含量随着氮素的增加而升高，高氮处理达到最高，这可能是高浓度的氮素胁迫导致燕子花植株体的细胞膜脂出现一定的损伤，损坏了燕子花叶片细胞膜的完整性.而脯氨酸和可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质，植株在受到逆境胁迫时，体内渗透调节物质含量显著增加，提高细胞原生质浓度，以增强抗逆性[51-52].本研究中可溶性糖含量和脯氨酸含量随着氮素的增加而增加，可能是燕子花对于氮素过量的一种适应机制，表现出了一定的生理渗透调节能力的改变.

植物资源优化配置理论认为，植物各器官生物量分配的变化是应对环境因子的变化，更好地获取空间、光照、水分、营养等有限资源，扩大植物适合度的重要机制[53-54].植物开花物候是对环境的综合反应指标之一，作为植物物候的一个方面，开花物候涉及始花期和开花持续时间等，[55]开花物候往往也随环境中养分的波动而有所改变，[28]特别是环境的变化往往造成花寿命的延长或缩短，而花的寿命与植物繁殖成功率密切相关[56].本文的研究结果表明，低氮处理下植株始花期和开花数量与对照组有一定的差异，花部综合特征(垂瓣长宽、旗瓣长宽、雌雄蕊高度)具有显著改变，反映了低氮添加使得绝对生殖资源投入有一定的减小.但是低氮组与对照组相比，其开花持续时间、花粉数、胚珠数、花粉活力和柱头可授性均不存在显著性差异，表明氮素过量条件下，植株繁殖投资保持相对稳定，这个趋势与繁殖保障假说预测的结果相同[57].而高氮组(15 g/m2的氮素添加)对燕子花植株表现出一种较为严重的氮素胁迫，为了保证自身的存活提高对环境的适合度，燕子花选择将资源全部分配给生长和维持存活，这也是对高氮胁迫的一种响应机制.由此可见，原生湿地土壤氮素含量对于燕子花生长较为适宜，当地管理部门应该严控湿地周边农田氮肥的使用，以免氮肥通过地表水和地下水输入湿地，对湿地植物燕子花种群造成不利影响.加强氮肥的合理使用和湿地的管理对湿地的保护和修复工作具有重要意义.

[参 考 文 献]

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