纳米银对水体中硝化细菌活性的影响

陈姝颖，李海毅，李昭阳

(吉林大学环境与资源学院，吉林 长春 130012)

随着纳米技术的快速发展，纳米材料已广泛应用到工业、农业和畜牧养殖业等领域，进入环境中的纳米材料逐年增加，同时也不可避免地进入到水体中，[1]特别是银纳米粒子，一种常用的抗菌性纳米粒子.在众多抗菌材料中，无机含银纳米抗菌材料具有较广的抗菌范围，杀菌能力很强并且对环境的毒性效应较低，是目前使用范围最大的抗菌材料之一[2].然而随着纳米银的大量使用，其在环境中的影响和作用机制也引起了学者的广泛关注[3-5].

以往，研究人员对纳米银(AgNPs)进行了许多的体外毒性实验及其毒性作用机制的探讨.有研究[6-7]表明，纳米银包被材料的种类和直径大小可能对其毒害效果产生影响；针对不一样的细胞类型，例如对放线菌、细菌、真菌，其毒害效果也有所差异.Böhmert等[8]发现纳米银会产生活性氧和超氧阴离子，这些活性物质可以氧化细胞膜和脂质导致生物体细胞的受损和死亡.纳米银的毒性作用与纳米颗粒的粒径大小有关，Choi等[9]发现纳米银的粒径小于5 nm 时对细菌的毒性最强.硝化细菌在自然环境的氮循环中发挥着重要作用，而在水生态系统中由于纳米银的进入对硝化细菌产生的影响情况还知之甚少，所以本文研究了在不同AgNPs浓度、pH和天然有机质的条件下，纳米银对水体中硝化细菌的影响，以为水环境中纳米银的毒性效应研究提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

纳米银(AgNPs，1 mg/mL，粒径≤15 nm)购自广州艾普纳米科技有限公司；硝化细菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心.实验用水为实验室配水，供试水体的基本性质见表1.

表1 供试水体基本性质

1.2 实验方法

将细菌样品分散到配制的供试水体中，混匀后逐级稀释至适当倍数.取100 μL稀释液涂布于斯蒂芬逊培养基平板上，恒温(25℃)恒湿培养，通过菌落数和稀释倍数计算出实际菌量.所有实验设置3个平行，每个平行2次重复.

抑菌率(%)=100×(空白对照组菌量-处理组菌量)/空白对照组菌量.

1.3 数据处理与分析

实验数据统计分析和图表制作采用 IBM SPSS Statistics 19，Microsoft Office Excel 2010和OriginPro8.SR3软件.

2 结果与讨论

2.1 不同质量浓度的纳米银对硝化细菌活性的影响

将一定量硝化细菌加入到AgNPs质量浓度分别为0，5，10，15和20 μg/mL的1 mL水体中，混匀后分别取出100 μL在培养基上进行培养，培养温度为25℃，pH=7.2.在培养的第0，2，4，6，8和10天分别计数.AgNPs对硝化细菌活性的影响结果见图1.

由图1可见，整个实验期间未添加AgNPs水体的空白对照组硝化细菌的数量均高于添加组，且差异均显著；AgNPs质量浓度为0和5 μg/mL的两个处理组随着处理时间的增加硝化细菌的数量先增加后降低，这是由于土壤中一开始有可供应硝化细菌生长繁殖的营养物质，随着硝化细菌的增加，营养物质减少，细菌产生了竞争和饥饿导致数量减少.AgNPs质量浓度为10，15，20 μg/mL的3个处理组，硝化细菌的数量呈先下降、后上升、再下降的变化趋势，产生这种现象的原因可能是由于最初AgNPs的质量浓度较高，对硝化细菌的毒性较大，进而导致硝化细菌死亡；随后硝化细菌产生抗性并进行繁殖，数量有所回升；而后期营养物质减少又导致数量再次下降.由此可知，AgNPs对硝化细菌有一定的抑制作用.AgNPs与生物分子相似而且粒径细小，很容易被生物摄入细胞内，破坏细胞结构，扰乱细胞的正常代谢循环；同时，也可以溶解出相应的金属离子，造成一定的毒性.AgNPs对硝化细菌活性的抑制情况见图2.

图1 不同浓度AgNPs对硝化细菌的影响

由图2可见，硝化细菌的抑制率随添加的AgNPs质量浓度的增加而增大.AgNPs质量浓度为20 μg/mL时，在第2天硝化细菌的抑制率就达到了95%，在第10天达到了98%；AgNPs为5 μg/mL时，硝化细菌的抑制率在第4天才达到最大，为32.74%.所以高浓度和低浓度的AgNPs都会对硝化细菌造成一定的抑制作用.从图2还可以看出，AgNPs质量浓度为15和20 μg/mL时抑制率先增加然后逐渐达到平稳，说明硝化细菌对高浓度的AgNPs抵制能力较弱，进而很快受了抑制；而在AgNPs质量浓度为5和10 μg/mL时，硝化细菌的抑制率都是先增加后降低然后再增加，说明低浓度的AgNPs，对硝化细菌一开始有一定的抑制作用，但随着时间增加硝化细菌产生了抗性，进而继续生长繁殖数量增多，到后期在AgNPs和营养物质减少的双重作用下，细菌数量再一次降低，进而导致抑制率又上升.谢小保等[10]研究了纳米银粒子对大肠杆菌细胞的影响机制发现，纳米银粒子通过破坏细胞壁产生孔洞后进入周质空间，导致细胞膜成分渗漏，在破坏细胞膜的同时进入细胞内部，对细胞造成损伤；Kim等[11]研究了纳米银对白色念珠菌的作用，也发现了纳米银会进入细胞内部并对细胞内的DNA和细胞质造成伤害，导致细菌最终死亡.还有学者[12]研究了纳米银对大肠杆菌的影响，发现纳米银浓度会影响大肠杆菌细胞内脱氢酶的活性，并且随着纳米银浓度的增高而降低.Abbasi等[13]的研究表明，纳米银产生的活性氧既可以直接对细菌产生强氧化作用使细胞死亡，同时活性氧还可以对呼吸酶产生一定的抑制作用，间接导致细菌死亡.

2.2 纳米银对不同pH水体硝化细菌活性的影响

水体的pH是影响水体中微生物活动的重要理化性质之一，pH过高或过低都会对微生物的活性产生影响.而pH对AgNPs的环境行为也有一定的影响.将细菌分别加入到pH为3，5，7，9和11的AgNPs质量浓度均为10 μg/mL的水样中，混匀后取出100 μL进行培养.培养温度为25℃.在培养的第0，2，4，6，8和10天分别进行计数，结果见图3.不添加AgNPs时，pH对硝化细菌也有一定的抑制作用，抑制情况如图4所示.

图3 AgNPs对不同pH水体硝化细菌活性的抑制率

由图3可见，低pH值条件下AgNPs对硝化细菌的抑制率较强，而在高pH值条件下AgNPs对硝化细菌的抑制率有所减弱.在pH=3和pH=5时，抑制率在第6天达到最大，分别为96.97%和93.86%；而pH=11时，抑制率先上升再降低，在第6天达到最大为60.48%，而在第10天降到54.83%.由图4可见，不同的pH对硝化细菌也有一定的影响.当pH=7时，对硝化细菌先有一定的抑制作用，而随着时间的增加对硝化细菌的生长繁殖有一定的促进作用，但变化波动范围不大，在0.05%左右波动；而其他pH条件对硝化细菌也有一定的抑制作用，但是抑制率均在10%以内，pH=3时，抑制率在第2天为7.84%，之后趋于平缓.所以综上可以看出抑制硝化细菌的主要因素不是pH.

有研究[14]表明，低pH值条件下金属纳米颗粒易于金属离子释放，而高pH值条件则容易发生团聚.在pH值较低时，AgNPs释放大量的Ag+，较高浓度的Ag+会与细菌相互作用，对硝化细菌细胞产生毒性和胁迫导致细胞破裂和死亡，而Ag+和AgNPs的复合作用导致对细菌的毒性加强；pH值较高时，由于AgNPs发生团聚，降低了AgNPs与细菌接触的概率，毒性作用减弱，从而导致硝化细菌抑制率降低.

图5 水中添加腐殖酸AgNPs对硝化细菌活性的抑制率

2.3 纳米银对腐殖酸水体中硝化细菌活性的影响

天然有机质是水体和土壤环境中植物或微生物残骸经过一定的生物过程而广泛存在的一类复杂的有机物质[15].有研究表明，自然环境中存在的天然有机质会影响纳米颗粒物在环境中的行为[16].在pH=7.2，AgNPs质量浓度为10 μg/mL条件下，细菌培养温度为25℃时，本实验研究了腐殖酸的存在是否影响AgNPs对水体硝化细菌的抑制作用，结果见图5.体系中腐殖酸的浓度固定为50 mmol/L(以C计).

由图5可见，水体中添加腐殖酸明显降低了AgNPs对硝化细菌的抑制作用，随着培养时间的增加硝化细菌的抑制率先增加，在第4天抑制率达到最高，为13.38%；随后抑制率降低，第10天的抑制率仅为6.35%.由此可以看出，环境中广泛存在的天然有机质腐殖酸能够影响纳米颗粒物对水体中微生物的毒害作用.有研究[17]表明，纳米颗粒物的表面电荷会受到天然有机质的影响，天然有机质可以增强纳米颗粒物胶体的热稳定性以及提供静电斥力和空间位阻稳定纳米颗粒物胶体，从而可以使纳米颗粒物在水体环境中产生的团聚现象趋于稳定，并且降低纳米颗粒物对水体中生物的毒性.还有研究[18]发现，纳米颗粒物的表面包被了天然有机质，在水环境中减少了纳米颗粒和生物的接触概率，相应降低了纳米颗粒对水体生物的毒害作用.

3 结论

本实验研究结果表明，AgNPs在质量浓度0～20 μg/mL范围内均对硝化细菌有抑制作用，且浓度越高抑制率越高.低pH值条件下AgNPs易于金属离子释放，对硝化细菌的抑制率较高；而高pH值条件下AgNPs容易发生团聚，对硝化细菌的毒性作用减弱.腐殖酸能够促使水体中AgNPs的团聚趋于稳定，并且还能够包覆AgNPs降低对硝化细菌的毒性作用.

[参 考 文 献]

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