NGAL和VEGF在子宫内膜癌早期病变中的表达意义

穆启明，熊亚玲，姚文娟

湖北十堰市人民医院(十堰 442000)

子宫内膜癌是女性发病率和病死率较高的恶性肿瘤，在我国仅次于宫颈癌，在美国居首位[1]。研究[2]发现，子宫内膜癌细胞株HEC-1-A和 KLE可高表达中性粒细胞明胶酶相关脂质载运蛋白(neutrophil gelatinase associated lipid carrier protein，NGAL)，并与肿瘤的分化级别密切相关，认为可作为早期子宫内膜癌病变的标志物。子宫内膜癌荷瘤小鼠模型注射NGAL过表达腺病毒后发现，肿瘤凋亡率降低，凋亡基因p53表达减少[3]，因此认为，NGAL高表达可能抑制细胞凋亡。NGAL也称载脂蛋白-2或噬铁蛋白，在多种腺癌中高表达，如胃癌[4]、乳腺癌[5]和结直肠癌[6]等，通过与基质金属蛋白酶(MMPs)形成复合体，抑制MMPs降解[7]，释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[8]，促进血管新生、细胞增殖、分化、侵袭和迁移等[9-10]。该研究旨在分析子宫内膜癌组织中NGAL和VEGF的表达与肿瘤临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

连续选择2016年08月至2017年02月湖北十堰市人民医院诊断为子宫内膜癌患者50例为研究对象。纳入标准：1)经手术病理确诊；2)取得患者知情同意权。排除标准：1)近期有子宫手术史；2)有放化疗史；3)近期服用雌孕激素类似物等。患者年龄(58.2±14.5)岁(47～79岁)；腺癌40例，浆液性癌5例，透明细胞癌5例；FIGO临床分期Ⅰ期6例，Ⅱ期20例，Ⅲ期20例，Ⅳ期4例；低分化12例，中分化28例，高分化10例；肿瘤直径(2.9±1.4)cm (0.5～5.2 cm)。另选择经腹部超声或宫腔镜检查确定为正常子宫内膜组织患者50例作为对照，其中年龄(57.8±13.6)岁(43～75)岁。两组患者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 检测方法

分别采用免疫组化染色和RT-PCR法检测组织中NGAL和VEGF表达情况，分析其与肿瘤临床特征包括FIGO分期、病理类型、分化级别和肿瘤直径的关系。

1.2.1 免疫组化染色法 常规制作组织切片，厚度5 μm，经脱蜡、水化，抗原修复，封闭过氧化氢酶等处理后，滴加鼠抗人NGAL和VEGF单克隆抗体一抗(江苏碧云天科技有限公司，工作浓度1∶2 000)，置于湿盒内 4 ℃孵育过夜；PBS洗涤，滴加兔抗鼠IgG多克隆抗体二抗(江苏碧云天科技有限公司，工作浓度1∶500)，置于湿盒中27 ℃孵育 20 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(江苏碧云天科技有限公司)，置于湿盒中27 ℃孵育 20 min；PBS洗涤、DAB 显色、苏木素复染、氨水返蓝、脱水、透明、中性树胶封片、光学显微镜下观察。结果采用半定量法判读，依据染色强度和染色细胞比率：以胞浆或胞核黄染至深棕色为阳性，染色强度中无阳性染色为 0 分，弱染色为 1 分，中等强度为 2 分，强染色为 3 分；阳性细胞比率≤5%为 0 分，6%～25%为 1 分，26%～50%为 2 分，51%～75%为 3 分，>75%为 4 分；两项乘积0～3分为阴性，4～12分为阳性。

1.2.2 RT-PCR法 Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，根据Gene Bank序列合成NGAL、VEGF及内参β-actin正负向引物序列，反应体系总体积25 μL，反应条件96 ℃ 5 min，90 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、75 ℃ 60 s，共20个循环，75 ℃ 10 min结束。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物，凝胶成像后行灰度值分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织中NGAL和VEGF阳性表达与肿瘤临床特征的关系

NGAL和VEGF阳性表达与FIGO分期和分化级别有关(P<0.05)，FIGO分期越高，分化级别越低，阳性表达率越高；而与年龄、病理类型和肿瘤直径无关(P>0.05)(表1)。

注：*为确切概率法结果

2.2 NGAL和VEGF阳性表达率的比较

子宫内膜癌组织中NGAL和VEGF阳性表达率高于正常子宫内膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 NGAL和VEGF阳性表达率的比较[n(%),n=50]

2.3 NGAL和VEGF mRNA表达水平的比较

子宫内膜癌组织中NGAL和VEGF mRNA表达水平高于正常子宫内膜组织，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 NGAL和VEGF mRNA表达水平的比较

3 讨论

NGAL在腺上皮来源的肿瘤细胞中可明显表达，Yang等[11]研究指出，NGAL可促进人类乳腺癌细胞发生上皮间质转化(EMT)。Lim等[12]研究证实，NGAL表达可随肿瘤上皮细胞表型改变和EMT进展而逐渐消失。NGAL是一种分泌蛋白，具有多重生物学效应，在免疫和炎症反应、肾小管上皮形态转化和肿瘤发生中发挥重要作用。肿瘤细胞的代谢活动需要大量铁离子参与DNA和蛋白质合成，NGAL可提高细胞生物可利用铁活性[13]。利用无铁离子的空载 NGAL 与抗肿瘤药物复合形成靶向药物，特异性结合子宫内膜癌 细胞表面的 NGALR，可提高局部药物浓度，增强抗肿瘤作用[14]；同时提高细胞外铁转运至细胞内，抑制由于药物外排导致的耐药性[15]。

本研究结果显示，子宫内膜癌组织中NGAL和VEGF阳性表达率和mRNA表达水平较正常子宫内膜组织明显升高，其阳性表达与和分化级别有关。NGAL在子宫内膜癌中随组织分化级别降低，阳性表达升高，考虑与腺体细胞表型丧失，逐渐转化为间质细胞表型，NGAL 在上皮性癌细胞分化途径中可能发挥定向调控作用[16]有关。VEGF通过与其受体Flt4结合，激活酪氨酸激酶信号传通路，诱导子宫内膜癌细胞中淋巴和血管组织生成[17]。VEGF是调控肿瘤细胞持续增殖和定向迁移的重要细胞因子。同时，NGAL和VEGF阳性表达与年龄、病理类型和肿瘤直径无关，考虑原因与受试对象的基线资料有关，也可能NGAL和VEGF表达与子宫内膜癌的分化方向、细胞增殖特性方面相关性较小，具体机制还有待深入研究。

综上所述，NGAL和VEGF异常高表达与子宫内膜癌的发生、发展密切相关。本研究样本量较少，NGAL和VEGF诊断子宫内膜癌的准确性及能否成为干预的重要靶点还需进一步研究验证。

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