冻干机性能验证方法的建立和应用

魏荣华 周茂德 何申柔 原结梅

生物技术的不断发展为生物制药产业带来了崭新的发展前景，越来越多的新型药物被研制，然而多数的生物药品对制造环境相对苛刻，为确保生物制品活性在制造及保存过程中得到完好保留，冻干机的应用起到了重要作用，并被广泛用于生物医药行业[1-4]。

冻干机作为无菌生物制剂的关键设备，其各项性能指标关系到冻干产品的质量，如冻干机的清洗灭菌效果与冻干产品杂质混入、无菌要求方面息息相关[5-6]。板层控温性能也直接影响产品冻干过程的成型及药品的水分含量[7-9]。目前，2010版药品生产和质量管理规范(good manufacturing practices，GMP)和药品GMP指南中规定，药品生产使用的关键设备，安装和调试完成后，在投入生产前及运行一定时间后必须对其性能进行确认，以确保设备性能仍能符合工艺需求[10-11]。

结合产品的工艺需求，本研究对广州白云山拜迪生物医药有限公司使用的楚天科技股份有限公司生产的LYOTK5冻干机的抽真空速率、在线清洗与灭菌(cleaning in place /sterilisation in place，CIP/SIP)系统、板层温度均匀性等性能进行确认和探讨分析。

1 材料与方法

1.1 验证材料

材料包括测试仪器和指示剂两部分。

(1)测试仪器。Power 3000温度验证系统(深圳市研工科技有限公司)；IntegtestTM V4.0型便携式完整性测试仪(北京钮因华信科技发展有限公司)。

(2)指示剂。灭菌生物指示剂(ATCC7953上海福泽医药器材有限公司)。

1.2 验证方法

1.2.1 冻干机抽真空速率测试

(1)启动冻干机。根据冻干产品工艺需求设置冻干机真空度为25 Pa，并进行抽真空测试，需3次重复测试。

1.2.2 冻干机在线清洗CIP覆盖率

(1)在整个冻干腔体的内表面喷洒一层维生素B2水溶液，浓度为15 mg/L，特别注意难以清洗部位(如管口，箱体顶部和板层下方)要喷洒完全。开启注射用水，启动CIP循环，完成CIP后，用荧光灯照射检查腔体内表面，寻找是否残留有维生素B2荧光物部位，进行3次重复的测试。

(2)合格标准。CIP清洗后的腔体内部表面无可见荧光物，清洗覆盖率100%(参考药用真空冷冻干燥机行业标准JB/T20032-2012)。

1.2.3 呼吸器性能测试

(1)呼吸器完整性检测。使用IntegtestTMV4.0型便携式完整性测试仪，在2500 mbar的测试压力下，使用水浸入法检测呼吸器的完整性。

(2)呼吸器在线灭菌效果。在呼吸器内放置1支灭菌生物指示剂，运行冻干机在线灭菌SIP程序，与在线灭菌SIP测试同时进行。灭菌结束后取出指示剂进行培养，进行3次重复测试。

本研究结果显示，该地区海勤女性人员的总体健康状况和情感职能等维度的得分均高于国内同性别同年龄段人群，其他维度得分差异无统计学意义，提示女性海勤人员具备良好的身体素质和心理素质，适应环境能力强。但是，男性海勤人员生理功能、生理职能、躯体疼痛、一般健康状况、社会功能、情感职能等维度得分均低于国内同年龄段同性别人员，提示由于特殊的生存环境，男性身体和心理可能受到了一定的影响，因此需加强海勤特殊工作环境下男性海勤人员身体健康和心理健康防护，提高男性海勤人员健康生命质量。

(3)合格标准。最大流量≤4.5 ml/min，灭菌后的生物指示剂应无菌生长(参考滤芯生产厂家-美国亚美滤膜有限公司出厂标准)。

1.2.4 在线灭菌SIP测试

(1)前校准方法。验证前将验证用温度探头和标准温度探头同时放入温度干井，进行前校准；设置温度为100 ℃、132 ℃及121 ℃，进行3点校准；校准读取偏差应＜0.5 ℃。

(2)将校准后的温度探头通过验证口接入冻干机内，放置24支度探头，数字1～5为冻干机各板层，6为冻干机底面。运行冻干机的SIP程序，灭菌温度121 ℃，灭菌时间20 min。进行3次重复测试。验证测试完成后将使用温度探头进行后校验，校验点设置为121 ℃，后校验读取偏差应＜0.5 ℃(如图1所示)。

(3)冻干机灭菌生物指示剂挑战测试。在每一个温度探头附近各放置1支生物指示剂(1～24#)，探头编号与指示剂编号一致，冻干机的SIP程序结束后取出指示剂进行培养。

图1 在线SIP温度探头放置示意图

(4)合格标准。依据国家标准GB-8599-2008“大型蒸汽灭菌器技术要求自动控制型”，灭菌阶段同一时刻温度最热点与最冷点的温度偏差≤2 ℃，温度最小值≥121.0 ℃；依据卫生部令第79号“药品生产质量管理规范(2010年修订)”，同时结合产品工艺要求，各温度点F0≥15 min，灭菌生物指示剂在线灭菌后应无菌生长。

1.2.5 冻干机板层温度均匀性测试

(1)前校准。验证前将验证用温度探头和标准温度探头同时放入温度干井，进行前校准，设置温度为-50 ℃、-40 ℃、0 ℃、40 ℃及50 ℃的5个点，进行5点校准，校准读取偏差应＜0.5 ℃。

(2)将校准后的温度探头通过验证口接入冻干机内，放置1～23#温度探头，数字1～5表示为冻干机产品板层，T11～3#为温度探头放置在第3板层的硅油进出口及中心位置，其他温度探头均按图放置在每个板层的4个角及中心位置(如图2所示)。

图2 板层均匀性温度探头放置示意图

启动冻干机，将导热油温度分别设置为-40 ℃、0 ℃以及40 ℃的3个点，导热油进出口温度在每个设置温度点达到平衡后，运行30 min，分别考察保持在-40 ℃、0 ℃及40 ℃时，板层温度的均匀性。进行3次重复测试。验证测试完成后将使用温度探头进行后校验，校验点设置为-40 ℃、0 ℃及40 ℃的3个点，后校验读取偏差应＜0.5 ℃。

表1 冻干机抽真空速率测试结果

表3 在线SIP测试结果

表4 板层温度均匀性测试结果(℃)

(3)合格标准。依据国家制药机械行业标准JB_T 20032-2012“药用真空冷冻干燥机”，同时结合产品工艺要求，保持在-40 ℃、0 ℃及40 ℃时，各板层的所有测试点在同一时刻温度最大值与最小值温差应≤2 ℃，板层均匀性合格。

2 结果

2.1 冻干机抽真空速率测试结果

冻干机抽真空程序。真空度到达25 Pa以下时，冻干机抽真空速率测试均在标准要求以内，见表1。

2.2 冻干机在线清洗CIP覆盖率测试结果

对喷洒维生素B2水溶液的冻干腔体进行在线清洗CIP测试，3次重复试验观察结果显示均无可见荧光物，清洗覆盖率为100%。

2.3 呼吸器性能测试结果

采用水浸入法检测呼吸器滤芯完整性，测试结果显示，同时3次在线灭菌后灭菌生物指示剂培养结果为阴性，无菌生长，见表2。

表2 滤芯完整性测试结果

2.4 在线灭菌SIP测试结果

温度探头前校准和后校验读取偏差均＜0.5 ℃，校准确认合格，在线SIP验证有效。运行程序进入在线灭菌阶段后，统计灭菌阶段同一时刻温度最热点与最冷点的温度偏差均≤2 ℃，温度最小值≥121.0 ℃，各温度点F0≥15 min，生物指示剂在线灭菌后培养结果为阴性，无菌生长，见表3。

2.5 冻干机板层温度均匀性测试结果

温度探头前校准和后校验读取偏差均小于校准标准0.5 ℃，校准确认合格，板层温度验证有效。板层所有测试点在同一时刻温度最大值与最小值温差≤2 ℃，各设置温度点的板层测试结果见表4。

3 结论

广州白云山拜迪生物医药有限公司所使用的LYOTK5冻干机经过测试验证，在线清洗CIP系统清洗覆盖率为100%，冻干机箱体内的每个裸露部件和死角部位均能清洗彻底；在线灭菌SIP系统通过物理参数和生物指示剂两方面进行评估，灭菌阶段温度偏差均在2 ℃以内，温度最小值≥121.0 ℃，各温度点F0≥15 min，灭菌效果好，能够有效保证冻干机箱体的无菌生产环境；板层温度点温差≤2 ℃，温度分布均匀可使得整批冻干产品质量均一。冻干机各项性能指标测试结果数据显示所使用的冻干机均能达到生产要求，可有效保证公司产品的冻干质量。

本研究通过实践一系列的测试方法，建立一套适用于公司冻干机性能验证的方法，为今后冻干机验证及生产工作的顺利开展提供依据。

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