中药成分肠吸收模型研究进展与思考

何帅，蔺明煊，姜亦南，王少男，石晋丽(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

中药化学成分复杂，因传统研究模式周期长、难度大，导致多数中药材有效成分不清楚；中药有效部位的开发是中药材利用的重要途径，存在着组成和比例不清、忽视非有效部位的协同作用等问题，导致其质量控制水平不高，疗效难以充分发挥。因此，探索快速、简便筛选及优化中药有效成分群及其比例的方法，具有很好的理论和实际意义。中药肠吸收谱与药物谱、药效谱结合可以快速、简便地筛选、优化中药材有效成分群。中药肠吸收模型的应用较为广泛，多用于研究结构和活性较为明确的中药单体、单味中药和中药复方的有效吸收成分及其相互作用规律[1]。目前关于药物肠吸收研究的综述较多，但是大部分只针对某一种或三种主要的肠吸收模型(单向肠灌流法、循环肠灌流法、外翻肠囊法)进行应用及优缺点的总结，不够全面和深入。鉴于此，本文总结了包括体外法(大鼠肠囊、尤斯灌流室Ussing Chamber法、细胞培养模型法、平行人工膜渗透模型法等)、在体法(单向肠灌流法，循环肠灌流法，肠襻法等)以及体内法(血液、尿液药物浓度法)三大类型[2]在内的近几年国内外有关肠吸收的实验模型，并对各种方法的准确性和可信度进行描述，对各种方法的不足之处进行探讨，全面而深入地总结了各种模型在实验过程中的注意事项，为中药有效成分群筛选的相关研究提供参考，进而为中药新药的发现和临床上中药的合理使用提供借鉴。

1 体外法

体外法(ex vivo/in vitro)分为两类：一类是分离动物肠黏膜/肠段来评价药物肠吸收；另一类是分离人肠细胞并给予模拟的肠环境，进而分析药物的肠吸收情况[3]。常用的体外法模型主要有大鼠肠囊法、尤斯灌流室法、细胞培养模型法、平行人工膜渗透模型法。

1.1 大鼠肠囊法

1.2 尤斯灌流室法

1951年，丹麦学者Hans Ussing首次将Ussing chamber (尤斯室，或尤斯灌流室)介绍于世，其主要功能是通过给离体上皮组织提供一个模拟体内生理条件的环境，并利用电压电流钳技术，研究营养物质、药物及离子等跨上皮的转运。Ussing Chamber技术是目前常用的研究药物胃肠道吸收的体外方法之一，通过微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号，来反映肠道药物吸收、通透性和分泌情况的变化[9]。该方法[10]是将适当大小的肠黏膜固定在相互连接的黏液和浆膜液之间，在各孔之间插入槽，测量药膜两侧的药量，计算药物从黏膜到浆膜吸收率。该模型研究葵酸脂对肠P-糖蛋白底物转运的影响[11]。结果表明葵酸脂可能作为P-糖蛋白抑制剂改善受P-糖蛋白介导的药物的吸收，增强口服药物的生物利用度。具有以下优点：①研究药物特定肠段的吸收、分泌过程；②可以研究药物转运的不同阶段；③操作简便快捷；④能更准确地反映体内各种上皮细胞的实时状态[12-13]。但其缺点为：①该数据较少且较为简单，而肠黏膜系统较为复杂，因此可靠性真实性较差；②从获得肠上皮到尤斯灌流试验通常需要1 h以上，此期间缺乏血液和神经供应，手术进程中组织的形态和结构容易破坏，生物活性必然下降，影响实验结果[14]。目前的解决方法是在运输液中加入组织活性防腐剂来保持或减少肠道形态和生理活性的下降，未来有待于出现一种新的方法来保持肠段的生物活性，来保证结果的可靠性。

1.3 细胞培养模型

研究细胞和分子水平的药物吸收模型有很多，如Caco-2，HT29-MTX细胞模型等。Caco-2细胞是人类结肠腺癌上皮细胞，在培养的过程中可以自行分化成类似人成熟的小肠上皮单层细胞，含有与小肠刷状缘上皮相关的酶，能够在细胞水平提供关于药物分子通过小肠黏膜的吸收、代谢、转运信息[15]。因此，Caco-2细胞模型做为研究小肠上皮细胞药物转运和代谢的体外模型，广泛应用于口服药物的筛选和药物肠吸收过程的研究[4,16]。方法为：(1)培养细胞：将细胞培养复苏、传代；(2)种板：将培养过的细胞放于聚碳酸酯膜上；(3)检测：进行单层细胞级性和完整性检测，测量电阻值TEER，并进行荧光素钠转运实验及碱性磷酸酶活性测定、细胞摄取、细胞转运实验。整个装置在培养基中进行，细胞板顶侧放药物，底侧检测。该方法优势[17]为：①方便简捷：Caco-2细胞容易培养，有强大的生命力；②能够测定药物的细胞摄取和细胞跨膜转运；③Caco-2细胞与肠上皮细胞具有药物代谢相似的酶类，可以检测代谢条件下药物的跨膜转运；④Caco-2细胞的来源是人结肠癌细胞，具有良好的同源性；⑤可以用来区分不同的肠道吸收通道。但也有一定缺点：①缺少肠壁的黏液层，与真实环境有差异，结果可能有误差；②缺少细胞异质性(单一细胞构成)；③缺少部分代谢酶；④Caco-2细胞屏障特性与结肠上皮细胞类似，而与小肠上皮细胞有一定差别；⑤所需助溶剂多有毒性。Caco-2模型现已被认为是小分子药物口服吸收的体外筛选模型，并且适用于药物开发的早期阶段以研究药物吸收过程。但该模型仅为细胞水平上的研究，若要提高实验结果的准确性还需进一步与整体动物实验相结合[15]。

1.4 平行人工膜渗透模型

平行人工膜渗透模型(PAMPA)主要是将人造磷脂作为生物膜去模拟药物跨膜屏障进行药物膜通透研究。具有高通量、低成本、用药量少、灵活性高等优点[18],是研究药物通过生物膜吸收的理想的体外模型。然而也存在局限性，例如只有被动扩散机制，较为单一，对亲脂性的小分子化合物不能阐明是由旁细胞渗透途径还是被动扩散途径穿过细胞膜，且无法精确预测主动转运机制下的药物渗透率。Caco-2细胞、MDCK细胞模型与平行人工膜渗透模型联用，是避免上述问题的有效方案。平行人工膜渗透模型作为药物的初步筛选工具已经被广泛应用，且具有不可代替的优势。

2 在体法

在体法(in situ)是动物水平上的实验。常用方法包括单向在体肠灌流法、循环肠灌流法、肠襻法。

2.1 在体肠灌流法

该法是通过测定药物经肠段后灌流液损失的量而计算药物渗透系数的方法，能够从器官灌流水平研究药物在不同浓度、pH等条件下结肠、回肠、空肠、十二指肠的吸收[7]。以下分别介绍单向肠灌流和循环肠灌流法。

2.1.1 单向肠灌流法

取大鼠，麻醉，保持体温。腹部插管连接蠕动泵，用K-r液平衡，然后灌入药物，定期抽取样品以测量药物浓度随时间的变化。吸收速率常数(Ka)、膜表观渗透系数(Papp)等动力学参数是其主要检测指标。该模型优势为：①操作简便；②保证肠道神经的完整性及体液的供应，指标更加接近动物体内的真实吸收情况；③测得的吸收速率等指标与人体的体内吸收具有一定的相关性[19]；④模型已被美国FDA认可，应用更广泛。但该模型也有一定缺陷：①胆汁进入十二指肠会对肠中药物成分的吸收产生影响，需要将胆汁引流或胆管结扎；②灌流管路对药物成分产生物理吸附，在实验前需要对灌流管路进行饱和；③灌流液需要较高的溶解度，若极性小的药物如环烯醚萜类需要加入吐温-80、CMC等助溶剂，但助溶剂有毒，用量不规范容易造成溶血等副反应；④肠道会对灌流液中的水分吸收、排泄，应采用重量法进行校正，不易计算药物吸收率。实验过程中应注意：在灌流之前需要矫正蠕动泵的流速，其理论值和实际值往往有差别；大鼠麻醉时应使用乌拉坦，同时应注意麻醉剂的用量，使得大鼠保持麻醉良好的状态，若中途大鼠恢复意识，应注意及时补充麻醉剂；肠灌流时应注意大鼠肠道的摆放应尽量避免有死角出现，否则药液无法匀速流出，影响实验结果；实验过程中要时刻注意大鼠肠管外壁保持温度和湿度，否则易干涩影响其生物活性。总之，单向在体肠灌流法应用较为广泛，适用于多数药物肠道吸收的研究。

2.1.2 循环肠灌流法

循环肠灌流与单向在体肠灌流的不同之处在于其灌流系统为循环式，灌流液可循环利用。巩仔鹏[20]采用循环肠灌流法检测出羊耳菊提取物9种成分在小肠均有吸收，但各成分的吸收速率、最佳吸收部位及吸收机制不尽相同。虽然国内常用循环灌流模型，操作上较单向肠灌流更简便，但该方法灌流时间较长，速度较大，对肠黏膜损伤较大，易导致肠吸收值偏大，而单向在体灌流法因只考察某一段肠，所需流速较低，吸收速率稳定，对肠黏膜损伤较小[21]。

2.2 肠襻法

麻醉大鼠，打开腹腔，选择所要研究部位的肠段，结扎而形成肠襻。方法为将药液灌注于肠襻中，一定时间过后，取出肠襻，测定肠襻中的剩余药量，来观察药物在肠中的吸收情况。该法优势为：①没有切断血管和神经，肠段完整性高，结果更准确客观。②不用排出肠内容物，与在体肠灌流法比较，其操作较为简单。然而，由于存在肠内容物，其样品处理较为复杂，所以实验数据的准确性也较差，不适合大规模的药物筛选评价，但是仍可作为其他模型的有益补充[22]。

3 体内法

体内法(in vivo)主要为动物的体内研究。经口给药后，在不同时间点采集血液、尿液等(全血和血浆都可用于进行测定)，用HPLC测定药物浓度，绘制体内药物的经时曲线，计算Cmax、Tmax等药动学参数来评价药物吸收的速度和程度。其优点为：体内法为全身代谢法，接近于体内条件，能够最真实地反映药物在体内的总体吸收情况。其缺点为：①个体动物间的巨大变异，可能导致实验的平行失调，所以需要大量的实验动物，大剂量的药物，大量的研究时间；②实验周期长，影响因素复杂；③由于某些疾病可能影响肠道的吸收和代谢，因此应该慎重考虑是选择病理模型还是正常动物进行吸收研究[12,22]。

综上所述，体外法的优势在于操作简单，节约时间，但是无法保证血液的正常供应和神经系统的完整性，生物活性相对较差，实验结果与真实情况有所偏差，所以该模型可用于早期药物高通量的筛选，或者与在体和体内模型相结合，来全面反映药物在肠道的吸收情况；在体法的优势在于操作简单，保证了血液的正常供应和神经系统的完整性，可以较为真实地反映药物在肠道的吸收，目前应用较为广泛，可与体外法相结合来全面反映药物在肠道的吸收；体内法的优势在于最能够反映药物在体内的吸收情况，但实验周期长，影响因素多，无法特异性地反映药物在肠道的吸收情况。总的来说，实验结果的真实性准确性为：体内法>在体法>体外法；操作及装置的简捷性为：体外法>在体法>体内法。所以，要想全面真实的地反映药物在肠道的吸收情况，需将几种模型结合，优势互补。

评价肠道药物吸收情况的方法有很多，且不同的研究方法均能够从不同的角度了解药物肠内药物的吸收情况。但每一种方法均有各自的优缺点。在体肠灌流法是现在应用最为广泛的方法，国内使用循环灌流法较多，然而国外倾使用单向灌流法较多，其中单向灌流法可用于研究大部分的药物吸收。肠襻法应用较为局限，但可以辅助其他实验模型。仅来自一种肠吸收模型的数据不能提供确定的结果，因此，在研究不同的药物时可同时使用两种或两种以上吸收模型。实验人员应该熟悉每一种模型的应用，每一种模型的优缺点，进而更合理地利用肠吸收模型并对实验结果进行辩证观察，得出最客观的结论。随着医学知识和技术的进一步发展，相信未来会研究出更为完善的肠道吸收模型，可快速筛选中药有效成分群，进而为中药新药的发现和临床上中药的合理使用提供借鉴。

[1] 吴涛,郑娟,张程亮,等.中药肠吸收的研究进展[J].药品评价,2013(6):30-35.

[2] Fox C B, Kim J, Le L V, et al. Micro/nanofabricated Platforms for Oral Drug Delivery[J].Journal of Controlled Release,2015,219:431-444.

[3] 左克源.Caco-2细胞模型的建立及在口服药物吸收中的应用[D].武汉：华中科技大学,2007.

[4] Wei L, Hao P, Zhang C,et al. Developments in Methods for Measuring the Intestinal Absorption of Nanoparticle-Bound Drugs[J].International Journal of Molecular Sciences, 2016,17(7):1171.

[5] 龚慕辛,王雅璕,宋亚芳,等.外翻肠囊法快速发现吴茱萸汤吸收成分群的研究[J].中国中药杂志,2010,35(11):1399-1404.

[6] 许永崧,潘学强,龚慕辛,等.吴茱萸汤外翻肠囊吸收成分与原药中各成分相关关系研究[J].中草药,2014,45(17):2490-2498.

[7] 张宜凡,王跃,肖娟,等.外翻肠囊法研究黄芩清肺汤肠吸收成分[J].药物分析杂志,2013(5):730-736.

[8] 沈芸,徐蓓蕾,杨新宇,等.三种研究药物肠道吸收机制的方法[J].哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2016,32(1):11-13.

[9] 陈立峰,董晗,郑骏,等.尤斯灌流室系统应用的研究进展[J].中国医疗设备,2016,31(11):73-77.

[10] Bergmann H,Rogoll D,Scheppach W,et al.The Ussing type chamber model to study the intestinal transport and modulation of specific tight-junction genes using a colonic cell line[J].Molecular Nutrition Food Res,2009,53(10):1211-1125.

[11] 林玉莲,蒋学华,杨俊毅.Labrasol对肠P-糖蛋白功能的影响[J].华西药学杂志,2005,20(2):139-142.

[12] 赵博欣,孙亚彬,段炼,等.应用Ussing Chamber技术评价芹菜素与柚皮素经大鼠肠黏膜透过特征[J].中国药学杂志,2011,46(20):1581-1586.

[13] 祝诚诚,何新.药物肠道吸收研究方法[J].药物评价研究,2010, 33(3):222-227.

[14] 孙志洪,贺志雄,张庆丽,等.尤斯灌流系统在动物胃肠道屏障及营养物质转运中的应用[J].动物营养学报,2010,22(3):511-518.

[15] 关溯,陈孝,黄民.Caco-2 细胞模型-药物吸收研究的有效“工具”[J]．中国药理学通报,2004,20(6):609-614．

[16] Braun A,Hammerle S,Suda K,et al.Cell cultures as tools in biopharmacy[J].European Journal of Pharmaceutical Science,2000,11(suppl 2):S51-S60．

[17] 张艳,王平,王进荣,等.在体单向肠灌流模型研究大黄素的大鼠肠吸收特性[J]. 中药新药与临床药理,2012,23(3):286-290.

[18] 吴一凡,刘晖,倪京满.平行人工膜渗透模型及其应用进展[J].药学学报,2011(8):890-895.

[19] Lozoya-Agullo I,Zur M, Fine-Shamir N, et al. Investigating drug absorption from the colon: Single-pass vs. Doluisio approaches to in-situ rat large-intestinal perfusion[J]. International Journal of Pharmaceutics,2017,527(1-2):135-141.

[20] 巩仔鹏.李梅.侯靖宇,等.基于在体循环肠灌流模型分析羊耳菊提取物的肠吸收特性[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(2):1-8.

[21] Liu J Y, Lee K F, Sze C W, et al. Intestinal absorption and bioavailability of traditional Chinese medicines: a review of recent experimental progress and implication for quality control[J]. Journal of Pharmacy & Pharmacology, 2013,65(5):621-633.

[22] 张字城,李新霞,李琳琳.动物肠吸收模型在药物研发中的应用[J].医学综述,2015,21(5):775-778.