MTT法检测灰直纹螟-青钱柳虫茶对肿瘤细胞体外增殖抑制作用

曾昭华，杨茂发， 2* ，杨再华

(1.贵州大学 昆虫研究所/贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 烟草学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550011)

虫茶是我国特有的林业资源昆虫产品，是由特种昆虫取食特种植物后的排泄物制成[1-2]。因此，虫茶资源包括产虫茶昆虫和寄主植物两部分，灰直纹螟-青钱柳虫茶(以下简称“虫茶”)的产茶昆虫为灰直纹螟Orthopygiaglaucinalis(Linnaeus)，寄主植物为青钱柳Cyclocaryapaliurus(Batal)。灰直纹螟，别名灰双纹螟、黄条谷螟、谷粗喙螟、黄边褐缟螟、干果螟，属鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)螟蛾亚科(Pyralinae)直纹螟属Orthopygia[3-4]；青钱柳Cyclocaryapaliurus(Batal) 又名青钱李(江西)、甜茶树(贵州)、一串钱(湖北)，隶属胡桃科Juglaruiaceae青钱柳属Cyclocarya，是我国特有的单种属植物，也是国家重点保护濒危植物之一[5]。

虫茶，作为茶文化中的奇葩与茶中奇珍，在湖南城步虫茶被称为“茶精”，而在广西龙胜则俗称为“龙珠茶”[6]。虫茶是一种集营养保健和药用价值于一体的保健饮料。虫茶中含有粗蛋白、粗脂肪、糖类、单宁、维生素、咖啡因等营养物质[7-8]，还含有人体所需的18种氨基酸[9]，其中必需氨基酸8种，这些均与优质茶叶并无多大差异。更可贵的是，虫茶还含有黄酮类、昆虫激素和凝血酶原以及磷、铁、锌、铜等多种微量元素[10-12]，这是任何优质茶叶无法比拟的。

乳腺癌和胃癌是人类最主要的两大癌症疾病，全世界每年约有120万女性患乳腺癌，其死亡人数高达50万，随着经济的快速发展，女性生活方式的显著改变，患乳腺癌的人数呈逐年上升趋势，但发病年龄逐渐降低。我国每年因胃癌死亡的人数居所有患癌死亡人数的首位(约占23.2%)[13-14]。目前，临床主要采用手术切除、化学药物和放射性三种方法治疗癌症，但无论哪种治疗方法都有一定的局限性，无法达到理想的治疗效果。因此，发掘具有抗癌作用的药物在医学上备受关注。据报道，虫茶有一定的抗癌效果，但不同虫茶品种及其对不同癌的效果差异较大，鉴于此，本实验拟采用MTT法检测灰直纹螟-青钱柳虫茶分别对MCF-7和SGC-7901肿瘤细胞增殖的抑制作用，为获得高效、低毒、安全的抗肿瘤药物提供科学的理论依据，同时也为虫茶产品的开发利用拓展更广的应用领域。

1 材料与方法

1.1 虫茶的制备

将野外采集的青钱柳嫩叶自然风干，然后放在紫外灯下杀菌，之后用于饲养灰直纹螟幼虫。收集其幼虫所排的代谢物，分别用14目、20目、30目、50目筛网进行依次筛选分离，由于幼虫不同龄期所排代谢物大小不同，经过不同规格筛网筛选分离后会获得不同大小的虫茶成品。将收集的虫茶成品放入60℃鼓风干燥箱内烘干后除尘，再用紫外灯杀菌后真空密封冷冻(-20℃)保存。

1.2 虫茶样品

虫茶：称取200 g虫茶用沸水提取3次，混合3次的虫茶提取液装入培养皿中，然后把培养皿放入冷冻干燥机中干燥，最后收集脱水干燥后的粉末作为虫茶样品冷冻(-80℃)保存备用。称取0.05 g虫茶样品溶解于10 mL培养基中作为母液，然后吸取母液逐一稀释成所需要的样品浓度。

1.3 癌细胞株

人乳腺癌MCF-7和胃癌SGC-7901细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.4 主要试剂

高糖DMEM(Hyclone 公司，美国)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，中国)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司，美国)；青链霉素(索莱宝公司，中国)；PBS缓冲液(北京鼎国昌盛生物公司)；3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)(Solarbio公司，美国)；二甲基亚砜(DMSO)(Amresco公司，美国)。

1.5 主要仪器设备

Marin Christ Alpha 1-2 plus 冷冻干燥机(Marin Christ公司，德国)；Thermo 3111型二氧化碳培养箱(ThermoFisher Scientific公司，美国)；Thermo全波长读数仪 Multiskan GO(ThermoFisher Scientific公司，美国)；生物安全柜(Telstar Technologies公司，西班牙)；离心机(Sigma公司，德国)；Motic 倒置显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司，中国)。

1.6 试验方法

1.6.1MTT法检测虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖抑制试验 将人乳腺癌细胞MCF-7体外培养于含10%灭活胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养基中，在5%CO2、37℃充分湿化条件下的培养箱中培养。取指数期生长的细胞，先用高糖DMEM完全培养基将细胞配置成单个细胞悬液；然后采用倍比稀释法，调节细胞的浓度为5×104个/mL；最后将调节好浓度的细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μL。将接种细胞的96孔板放入培养箱内培养12 h，吸出旧培养基，处理组每孔加入150 μL含有梯度浓度100、200、300、400和500 μg/mL的虫茶样品培养基，每组梯度浓度设10个重复孔，同时分别设有调零孔和对照组(CK)，把加好样的96孔板置于培养箱中分别培养24 h、36 h、48 h、72 h，不同时间处理实验独立重复3次实验。每组时间处理完毕后每孔加入10 μL MTT(5 g/L)，继续培养4 h后终止培养，小心弃掉上清液，然后每孔加入150 μL 二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速振荡10 min 后在酶联免疫检测仪490 nm处测量每孔的OD值。根据公式计算虫茶对肿瘤细胞的增殖抑制率(Cell viability inhibition)：

细胞增殖抑制率(%) = (OD对照组-OD实验组)/(OD对照组- OD空白组) ×100%

其中，空白组(blank)及为调零孔仅含有培养基没有接种细胞，对照组(control)用DMEM 完全培养基按正常方法培养细胞，其余作为虫茶实验组(treated)。

1.6.2MTT检测虫茶对人胃癌细胞SGC-7901体外增殖抑制试验 将人胃癌细胞SGC-7901体外培养于高糖DMEM(含10%灭活胎牛血清和1%双抗)中。置于5%CO2、37℃充分湿化条件下的培养箱中培养。实验处理和计算方法同1.6.1。

1.7 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7、胃癌细胞SGC-7901半数抑制浓度(IC50)

表1 虫茶对不同癌细胞的半数抑制浓度(IC50)Tab.1 The 50% inhibitory concentration of insect tea on different cancer cells(IC50)

注：表中数据为平均数±标准差。

IC50是评价一种药物在诱导细胞凋亡能力方面的重要的指标之一，由表1数据可知，虫茶对同一肿瘤细胞在不同时间段的诱导凋亡能力不同，如对人乳腺癌细胞MCF-7，24 h后虫茶的IC50为(887.43±1.68) μg/mL，72 h后虫茶的IC50为(136.68±1.14)μg/mL；而对人胃癌细胞SGC-7901，24 h后虫茶的IC50为(826.78±1.35)μg/mL，72 h后虫茶的IC50为(187.83±1.27)μg/mL。这表明，虫茶诱导肿瘤细胞凋亡随着时间的延长其作用效果越明显。同时虫茶对不同肿瘤细胞的诱导凋亡能力并不相同，如对人乳腺癌细胞MCF-7，36 h后虫茶的IC50为(322.17±1.42)μg/mL，48 h后虫茶的IC50为(178.72±0.94)μg/mL；但对人胃癌细胞SGC-7901，36 h后虫茶的IC50为(364.06±0.97)μg/mL，48 h后虫茶的IC50为(220.35±1.21)μg/mL。由此可知处理24 h之后的各时间段，虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制效果更好。

2.2 虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7的影响

图1结果表明：虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用与虫茶浓度及处理时间呈正相关。从图1A可知，虫茶处理72 h内虫茶浓度和抑制率成线性关系；48 h和72 h处理内虫茶浓度为500 μg/mL时抑制率几乎相等，其分别为(94.67±3.59)%和(95.18±2.48)%；由此可知一定浓度虫茶的抑制率达到其药效发挥的最大值时，其抑制率不会随着时间的延长而增大，这与其他抗肿瘤药物的特性相符。由图1B可知：虫茶浓度为500 μg/mL时48 h内其抑制率和时间成线性关系，48 h后其抑制率随时间的增加几乎不变，由此可知虫茶浓度为500 μg/mL时其最佳处理时间为48 h。

A-不同时间处理抑制率随虫茶浓度变化曲线；B-不同虫茶浓度处理抑制率随时间变化曲线

2.3 虫茶对人胃癌细胞SGC-7901的影响

由图2结果可知：虫茶对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率与浓度及处理时间呈正相关。从图2A结果可知，在48 h内虫茶浓度为100 μg/mL至400 μg/mL时其抑制率跟浓度成线性关系，分别为(31.82±2.32)%、(42.98±1.89)%、(54.97±2.13)%和(64.78±1.86)%，虫茶浓度为500 μg/mL时抑制率为(88.78±3.23)%，其增幅最大。图2B结果表明：虫茶浓度为500 μg/mL时处理48 h以前其抑制率跟处理时间呈线性关系，同时处理48 h和72 h的抑制率几乎相等，分别为(88.78±3.23)%和(90.92±2.27)% ，即虫茶对人胃癌细胞SGC-7901抑制的最佳浓度为500 μg/mL，最佳处理时间处理为48 h。

3 结论与讨论

恶性肿瘤是目前威胁人类健康的主要疾病之一。在我国，采用传统的中药来治疗恶性肿瘤的方式由来已久，相比于西药来说，中药在治疗恶性肿瘤方面有其非常独特的优势，如作用全面，有助于提高病人抵抗力并可延长病人寿命；药性温和，治疗过程中不会给病人带来难以承受痛苦；毒副作用小及病愈后不易复发等优点。近些年来，为寻找新型抗肿瘤药物，国内外学者掀起了一场研究和开发利用中草药的热潮。虫茶是我国的传统中药，明代李时珍在《本草纲目》中记载有“茶蛀虫，此装茶笼内蛀虫也，取其屎用，蛀屑聍耳出汁，缴净，摻之……”虫茶是最好的天然有机茶，它是动物和植物精华的结晶。虫茶馥郁甘冽，醇香宜人，具有清热解毒、祛暑降温、生津止渴、顺气解表、健脾益胃、增进食欲、明目益神、除乏去腻、消除疲劳、振奋精神、凉血降压、散瘀止血之功，对于燥热所致的鼻衄、牙龈出血，痔疮出血，以及增强血管弹性、韧性，降低血压、血脂、防治心血管疾病等症状，均有良好的疗效[15]。本实验的结果表明，灰直纹螟-青钱柳虫茶对人MCF-7乳腺癌细胞和SGC-7901胃癌细胞的体外增殖具有显著的抑制作用，其抑制效果与虫茶浓度的增加及处理时间的延长呈正相关，根据实验结果可知灰直纹螟-青钱柳虫茶对肿瘤细胞的增殖抑制作用与其它种类的虫茶有相同的抑制效果甚至更好，如冯霞等[16]和Qian等[17]研究表明，虫茶可以起到促进TCA8113人舌鳞癌细胞凋亡的作用；Zhao等[18]研究也发现虫茶对小鼠颊黏膜癌具有较好的抗癌效果；张静和赵欣[19]研究表明虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7生长具有相对最强的抑制效果；赵欣[20]发现虫茶中粗多酚(KMICP) 能完全抑制对人肝癌SMMC-7721细胞生长；Suo等[21]研究发现虫茶能诱导HepG2 人肝癌细胞的凋亡。同时邓潇潇和赵欣[22]、Zhou等[23]和王睿等[24]发现虫茶对小鼠胃损伤、胃溃疡以及肝损伤具有较好的预防及治疗作用；Liao等[25]通过建立动物模型研究发现虫茶水提取物可降低小鼠因Ccl4诱导引起的肝损伤以及在小鼠体内有较强的抗氧化能力。

IC50是评价一种药物在诱导细胞凋亡能力方面的重要的指标之一。灰直纹螟-青钱柳虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7和胃癌细胞SGC-7901的抑制效果并不完全相同，由本实验结果可知，虫茶处理48小时，对于人乳腺癌细胞MCF-7，虫茶的IC50为(178.72±0.94)μg/mL；对于人胃癌细胞SGC-7901，虫茶的IC50为(220.35±1.21)μg/mL。虫茶处理72小时，对于人乳腺癌细胞MCF-7，虫茶的IC50为(136.68±1.14)μg/mL；对于人胃癌细胞SGC-7901，虫茶的IC50为(187.83±1.27)μg/mL。这表明，不同的肿瘤细胞对于虫茶的敏感性具有差异，其原因很可能是由于不同的肿瘤细胞来源于不同的组织器官，它们之间具有基因表达的差异性以及不同的代谢特点，究其主要原因还需进一步的研究。

本研究结果表明：通过MTT法检测出灰直纹螟-青钱柳虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7和胃癌细胞SGC-7901具有明显的抑制作用，处理24 h后虫茶对人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制比对人胃癌细胞SGC-7901的抑制效果更好。灰直纹螟-青钱柳虫茶抗肿瘤效果与其他种类的虫茶具有相似之处甚至更好，这表明灰直纹螟-青钱柳虫茶具有极大的开发潜力。本研究的结果将为后面进一步筛选不同种虫茶针对某一肿瘤细胞具有更好的抑制作用提供科学的理论依据，同时为灰直纹螟-青钱柳虫茶的开发打下坚实的基础。本研究只从宏观方面探究了灰直纹螟-青钱柳虫茶对肿瘤细胞的体外增殖抑制作用，要摸清灰直纹螟-青钱柳虫茶诱导肿瘤细胞凋亡过程中的信号转导机制及获取虫茶的抗肿瘤活性成分还需进一步的探究。

致谢：贵州大学昆虫研究所研究生杨佳琪在细胞培养方面给予了大力帮助，新西兰奥克兰大学博士生刘健锋对论文提出了修改建议，在此一并表示衷心感谢！

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