不同产地连钱草中4个成分含量测定及聚类分析*

★ 黄文平 徐旭 李伟 李艳 谭婷* 冯育林 杨世林

(1.江西中医药大学 南昌 330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心 南昌 330006)

连钱草为(Glechomalongituba)为唇形科植物活血丹的干燥地上部分，其味辛微苦、性微寒，具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿之功效，临床上用于治疗热淋，石淋，温热黄疸，跌打扭伤等疾病。2015版《中国药典》对其进行收载，但无含量测定项[1]。研究表明，酚酸类化合物为连钱草中主要活性成分，绿原酸具有抗菌、抗纤维、抗炎的作用[2-6]，迷迭香酸为天然抗氧化剂，同时抗炎、免疫抑制作用显著[7-9]；咖啡酸具有抗菌抗病毒、中枢兴奋等作用[9-12]。由于受地理因素和生长环境的影响，不同产区的连钱草化学组成不尽相同。为了进一步固定药材来源，本实验共收集不同产区10批样品，采用HPLC同时测定样品中绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸及迷迭香酸共4个有效成分含量，并对检测结果进行聚类分析，考察不同产区连钱草药材的质量，为连钱草质量的完善提供依据。

1 仪器与材料

安捷伦LC-1260型高效液相色谱仪系列；AUW220D型电子天平(十万分之一，日本岛津公司)；BS224S型电子天平(万分之一，Sartorius)；KQ250DB型数控超声波清洗器(巩义市予华仪器有限责任公司)；KQ5200型水浴锅(昆山市超声仪器有限公司)。

绿原酸对照品(批号:110753-201415)，隐绿原酸对照品(批号:110753-201314)，咖啡酸对照品(批号:110885-200102)，迷迭香酸对照品(批号:111871-201404)，均购于中国食品药品检定研究所。甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

本实验收集到不同批次的连钱草样品共10批(见表1)，样品经江西中医药大学教授钟国跃鉴定为连钱草GlechomaLongituba真品。

表1 10批连钱草药材

2 方法与结果

2.1 连钱草药材供试品溶液 取连钱草药材粉末(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加60 %甲醇25 mL，称重，超声提取30min，称重，用60 %甲醇补足减失重量，滤过，滤液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸及迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含绿原酸0.012mg、隐绿原酸0.028mg、咖啡酸0.01 mg及迷迭香酸0.25 mg的混合溶液。

2.3 色谱条件 色谱柱:COSMOSIL(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:甲醇(A)-0.3 %磷酸水(B)，梯度洗脱(0～30 min, 10 %～25 % A；30～38 min， 25 %～40 % A；38～55 min， 40 % A)；流速:0.8 mL/min；柱温:25 ℃；检测波长:330 nm；进样量:10 μL；各待测组分分离度均大于1.5，理论塔板数均大于6000。混合对照品溶液、供品溶液色谱图见图1。

图1 混合对照品溶液(A)和供试品溶液(B)高效液相色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液1、3、6、10、15、20 μL 分别进样测定，以峰面积(Y) 为纵坐标，进样量(X) 为横坐标进行线性回归，得绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸的线性回归方程分别为:Y=6647.7722X-0.4216 (r=0.9999)、Y=2849.0452X-0.4216 (r=0.9999)、Y=6968.9569X-0.321 (r=0. 9998)、Y=1767.0006X+3.9569(r=0.9998)；绿原酸在0.012～0.24 μg、隐绿原酸在0.028～0.56 μg、咖啡酸在0.01～0.2 μg、迷迭香酸在0.25～5 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6 次，测得混合对照品中绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸峰面积的RSD(n=6)分别为0.74 %、0. 88 %、0. 82 %、1.02 %。

2.6 稳定性试验 取同一供试品(S8)溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h 进行测定，得绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸峰面积的RSD(n=6)分别为1.25 %、2. 46 %、2.71 %、0.63 %。

2.7 重复性试验 取连钱草样品(S8)，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，以“2.3”项下色谱条件进行测定，得绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸平均含量分别为0.4124、0.2115、0.0249、0.8913 mg/g，RSD分别为2.43 %、2.52 %、0.76 %、0.93 %。

2.8 加样回收率 精密称取已知含量样品1.0g，共6 份，分为3 组，按100 %的量各加入绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸平均回收率分别为100.64 %(RSD=0.93 %)、99.09 %(RSD=1.39 %)、99.30%(RSD=1.39 %)、101.23 %(RSD=0.86 %)，表明方法的准确度符合要求(n=6)。结果见表2。

表2 加样回收率实验结果

2.9 样品含量测定 取10批样品各3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下条件进行分析，结果见表3。

表3 样品测定结果 mg/g

注：“-”表示未检出。

2.10 聚类分析 采用IBM SPSS Statistics 21.0软件对4个酚酸成分含量进行聚类分析，采用组间联接聚类方法，距离的计算方法为Pearson相关性，进行层次聚类分析，见图2。通过分析可将上述10批次药材分为两类，长江以北(山东和河南)可以归为一类，长江以南(江西、云南、湖北、安徽、贵州、江苏及浙江)可以归为一类。从表3和图2中可以看出，不同成分，地域不同导致含量差异性比较明显。

3 讨论

本实验研究发现，流动相中水相含酸能明显改善酚酸类成分色谱峰的对称性，流动相采用有机溶剂乙腈与甲醇相比较，甲醇较乙腈分析效果更优。指标成分吸收波长经综合考虑，

选定330 nm为检测波长。

结果表明，10批连钱草样品，4个酚酸类含量存在一定的差异性，长江以北的批次(S8-S10)中绿原酸含量均值较长江以南的批次(S1-S7)的高，而(S8-S10)批次所含的迷迭香酸含量均值较(S1-S7)批次均值的低，推测可能由于地域的不同而导致含量的差异。因此在针对某一成分起功效时，可以选定特定产地的药材进行入药。本文收集样本较少，后续将扩大样本量并对各成分含量之间的相关性开展更深入研究。

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