上中下通用痛风汤对大鼠急性痛风关节炎模型TLR/ MYD88信号通路影响的研究❋

周丽雅，柴晶美，杨阿龙，马怡轩，李 欣

(长春中医药大学基础医学院，长春 130117)

痛风关节炎(gouty arthritis，GA)属于代谢性骨关节疾病，是由于机体对嘌呤类物质代谢发生障碍导致的血尿酸浓度过高、尿酸盐结晶沉积于关节周围组织，以关节炎症反应为主要表现的一种代谢性骨关节疾病[1-2]。目前现代医学对于痛风关节炎的治疗主要应用皮质激素、秋水仙碱、免疫抑制剂等药物，旨在通过抗炎和免疫抑制作用等控制痛风关节炎的发作症状，但在临床应用过程中存在副作用大、复发率高等问题。上中下通用痛风汤是由金元四大家之一朱丹溪所创制，出自《丹溪心法·痛风》，上中下通用痛风汤具有宣畅气机、清热化痰、活血行瘀、通络止痛之功效。本课题组前期研究发现，上中下通用痛风汤具有抗炎镇痛作用[3-5]，可降低关节肿胀程度和炎症因子表达。本研究将以TLR/ MYD88信号通路为切入点，进一步分析上中下通用痛风汤抗炎镇痛作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性SD大鼠 60只，体质量(200±20)g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供(许可证号SYXK(吉)2013-0005)。

1.2 药物与试剂

上中下通用痛风汤组方: 酒炒黄柏、苍术、天南星各60 g，桂枝、威灵仙、羌活各9 g，防己1.5 g，桃仁、白芷各15 g，龙胆草1.5 g，川芎60 g，炒神曲30 g，红花4.5 g。按常规方法煎煮后浓缩至生药1 g·ml-1， 4 ℃冰箱冷藏备用。吲哚美辛片(上海信谊万象药业股份有限公司)，尿酸钠(美国 Sigma)，SP试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)，TLR4、MYD88抗体(美国BD)，奥林帕斯光学显微镜BX51。

1.3 动物分组、给药及造模

清洁级雄性SD大鼠 60 只，体质量(200±20)g，随机分为正常对照组、模型组、吲哚美辛组(5 mg·kg-1)及上中下通用痛风汤高(20 g·kg-1)、中(10 g·kg-1)、低剂量组(5 g·kg-1)6组。正常对照组和模型组 ig 等量生理盐水，上中下通用痛风汤组ig给药，每日1 次，连续7 d，末 次 给 药1 h后按Coderre[6]经典方法，10% 水合氯醛[0．3 ml·(100)g-1，ip]麻醉大鼠，仰卧固定将大鼠左踝关节屈曲，扪及两骨突起局部消毒后，从两骨突之间进针，用注射器每只鼠注入尿酸钠溶液 50 μL，以对侧关节囊鼓起为注入标准，制备急性痛风关节炎模型。空白对照组左踝关节注射等体积的生理盐水。

1.4 检测大鼠踝周径变化值

在受试踝关节相同部位于造模前及造模后6、12、24、48 h，用软尺测量受试踝关节周长，观察造模前后受试大鼠关节周长的变化。

1.5 滑膜组织形态学检测

取各组大鼠左踝关节，多聚甲醛溶液固定 24 h，脱钙 1 周；脱钙后进行常规脱水、石蜡包埋，经髁突矢状面以5 μm厚度低温连续切片，苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察上中下通用痛风汤对痛风关节炎模型关节病理组织形态学变化。

1.6 滑膜组织TLR4、MYD88检测

采用SP免疫组织化学法检测各组大鼠关节滑膜TLR、MYD88蛋白表达情况。实验步骤按照说明书要求进行，染色结果褐色的表示TLR4、MYD88阳性表达。 采用平均吸光度值反映TLR4、MYD88阳性表达的强度，每例标本的被检区测 3张切片，采用 Image-Pro Plus 6.0 形态学图像分析系统进行分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 上中下通用痛风汤对尿酸钠致大鼠踝周径的影响

表1显示，与空白对照组比较,痛风关节炎模型组大鼠造模后6、12、24、48 h不同时间点大鼠踝周径均显著增加(P<0.05)。与模型组比较, 上中下通用痛风汤高剂量组大鼠在造模后随着时间延长，大鼠踝周径均显著降低(P<0.05);上中下通用痛风汤中剂量组及吲哚美辛组大鼠在造模后大鼠踝周径也显著降低(P<0.05)。中药中剂量组和吲哚美辛组比较差异无统计学意义，吲哚美辛组与中药高剂量组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，上中下通用痛风汤和吲哚美辛均能缓解大鼠关节肿胀，中药高剂量组优于吲哚美辛组。

表1 上中下通用痛风汤对大鼠踝周径的影响

注：与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与吲哚美辛组比较：3)P<0.05

2.2 各组大鼠踝关节滑膜组织病理观察

图1显示，空白对照组大鼠关节表面被覆透明软骨，关节囊腔光滑，关节滑膜细胞连续平整、结构层次清晰，未见滑膜肿胀、组织坏死、炎细胞浸润；模型组大鼠关节滑膜可见中度充血水肿、肿胀，伴有大量炎细胞浸润，滑膜细胞变性坏死，轻度增生；吲哚美辛组大鼠关节滑膜轻度充血水肿、肿胀、增生；上中下通用痛风汤高剂量组可见关节滑膜较平整、轻度充血水肿；上中下通用痛风汤中剂量组大鼠关节滑膜轻度充血水肿、肿胀、增生，滑膜细胞变性坏死；上中下通用痛风汤低剂量组大鼠关节滑膜轻度充血水肿、肿胀、增生，轻度炎细胞浸润，滑膜细胞变性坏死。病理观察显示，上中下通用痛风汤具有改善踝关节炎细胞浸润、滑膜组织破坏、血管扩张及充血功能。

图1 关节滑膜组织病理观察

2.3 上中下通用痛风汤对大鼠关节滑膜组织TLR4、MYD88表达的影响

表2显示,对照组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4与MYD88染色阳性区域较少，与对照组比较，模型组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4与MYD88阳性染色区域明显増大(P<0.05)；与模型组比较，吲哚美辛组滑膜组织中阳性染色区域值减小(P<0.05)；上中下通用痛风汤低、中、高剂量组滑膜组织阳性染色区域值与模型组比较均减小(P<0.05)。提示上中下通用痛风汤可降低痛风关节炎模型大鼠关节滑膜TLR4与MYD88蛋白表达。

表2 各组大鼠踩关节组织中TLR4、MYD88表达的IOD/area值

注：与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨论

痛风是属于机体嘌呤代谢紊乱所致的一类代谢性疾病，由于尿酸钠结晶在关节周围组织沉积而引起的急性炎症反应，其中炎症因子如PGE2、IL-1、TNF-α、IL-8等参与痛风关节炎的发生发展。当痛风患者体内嘌呤代谢异常血尿酸水平增高时，尿酸盐可以析出形成结晶并沉积在关节滑膜组织，伴有IL-1、IL-6、TNF等一系列促炎因子大量表达，导致关节局部出现急性炎症反应[7]。TLR4可识别作为机体内源性损伤相关分子模式的尿酸钠，启动其下游信号通路，诱导炎症因子合成并释放。有研究发现，TLR4缺陷小鼠关节炎的严重程度明显减轻[8]。 Qing 等[9]发现，急性痛风关节炎患者 TLR4 与 NF-κB 的表达明显高于正常健康者， 揭示TLR4 参与痛风关节炎的发生发展。本课题组前期研究发现，上中下通用痛风汤对急性痛风关节炎大鼠有显著抗炎镇痛作用，可通过降低动物体内白介素 IL-1、TNF、IL-6 等多种炎症因子的表达水平，对急性痛风关节炎有较好的治疗效果。本研究以TLRs/MYD88信号通路为切入点，探讨上中下通用痛风汤抗炎镇痛作用，揭示其作用机制。

本实验研究发现，急性痛风关节炎模型组大鼠关节滑膜组织TLR4、MYD88蛋白表达明显高于正常对照组，提示尿酸钠晶体可能通过被TLR4识别,并启动TLR4/MYD88信号通路，进而加重急性痛风关节炎大鼠关节组织的炎症反应。实验结果显示，随着TLR4与MYD88蛋白的升高，大鼠关节肿胀程度明显升高，而经上中下通用痛风汤治疗后，TLR4与MYD88蛋白下降，并伴有大鼠关节肿胀程度的降低，伴有关节炎症状显著改善，提示TLR4/MYD88信号通路在急性痛风关节炎发生发展中发挥着重要作用，上中下通用痛风汤可通过调节TLR4/MYD88信号通路发挥治疗作用，但其机理还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 吴霜霜,戚益铭,沈敏鹤,等.痛风关节炎中医证候规律及临床证治用药研究[J].长春中医药大学学报,2015,31(2):307-310.

[2] 姬艳波,李聪,廖立宏.痛风洗剂治疗急性痛风关节炎[J].长春中医药大学学报,2016,32(3):568-570.

[3] 李欣，邹佳宏，秦昊，等.上中下通用痛风汤对尿酸钠诱导急性痛风关节炎的抗炎镇痛研究[J]. 时珍国医国药,2013,24(8):1842-1844.

[4] 周丽雅，邹佳宏，李欣.上中下通用痛风汤治疗急性痛风关节炎及对Th17细胞的影响[J]. 中国实验方剂学杂志,2014, 20(9):199-202.

[5] 周丽雅，李欣，姜春霞.痛风通络方对尿酸钠诱导急性痛风关节炎的抗炎镇痛研究[J]. 辽宁中医杂志,2014,41(10):2237-2239.

[6] CODERRE T J,WALL P D.Ankle joint urate arthritis(AJU_A) in rats: an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund’s adjuvant[J].Pain,1987,28(3):379.

[7] 李钟,韩彬,黄惠珠,等.虎杖-桂枝药对配伍对急性痛风关节炎大鼠TLR4/My D88信号转导通路的影响[J].广州中医药大学学报,2015,32(6):1040-1045.

[8] SHI Y,EVANS J E, ROCK K L. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells [J]. Nature,2003,425:516.

[9] QING Y F,ZHANG Q B. Changes in Toll-like receptor (TLR) 4-NFκB-IL -β signaling in male gout patients might be involved in the pathogenesis of primary gouty arthritis [J]. Original Article,2014,34: 213.