神经营养因子—3在低氧环境中促进人骨髓间充质干细胞增殖

张善强　姚立杰　李宇　邓凤春　金海峰　沈雷

[摘要] 目的 探討神经营养因子-3（NT-3）在低氧环境中对人骨髓间充质干细胞（hBMSC）增殖能力的影响。 方法 在齐齐哈尔医学院分子生物学研究室利用三气培养体系建立低氧体外细胞培养模型，选取2016年5月购买的hBMSC，在低氧环境下，未行任何刺激的hBMSC为低氧对照组；用100 ng/mL人NT-3 重组蛋白刺激的hBMSC为NT-3组；先以MK2206作用30 min，再以NT-3刺激的hBMSC为Akt抑制剂组；正常氧浓度条件下培养的hBMSC为常氧对照组，各组均行成骨诱导实验21 d。分别用噻唑蓝细胞增殖、Western blot、酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验检测各组细胞增殖、凋亡，及VEGF和BMP-1等蛋白的表达。 结果 与低氧对照组相比，NT-3组hBMSC增殖OD值（1.438±0.116）明显提高差异有统计学意义（P<0.01），NT-3组VEGF及BMP-1蛋白含量（1.704±0.132）ng/mL；（1.794±0.098）ng/mL较低氧对照组均有增高差异有统计学意义（P<0.01）；相对于NT-3组，Akt抑制剂组hBMSC增殖OD值（0.927±0.103）降低差异有统计学意义（P<0.01），且Akt抑制剂组VEGF和BMP-1蛋白含量（1.428±0.205）ng/mL；（1.157±0.102）ng/mL均低于NT-3组差异有统计学意义（P<0.01）。结论 NT-3可提高hBMSC抗缺氧功能，促进hBMSC在低氧状态下增殖。

[关键词] 神经营养因子-3；骨髓间充质干细胞；增殖； 缺氧

[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）02（c）-0003-05

Neurotrophin-3 Promoting the Proliferation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Hypoxic Environment

ZHANG Shan-qiang， YAO Li-jie， LI Yu， DENG Feng-chun， JIN Hai-feng， SHEN Lei

Department of Anatomy， Qiqihar Medical College of Basic Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the effect of Neurotrophin-3 （NT-3） on proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cell （hBMSC） in hypoxic environment. Methods The hypoxic cell culture model in vitro was established by using three gas culture systems in the molecular biology laboratory of Qiqihar medical college， and the hBMSC purchased in May 2016 were selected. Under the hypoxic environment， the hBMSCs without any stimulation was used as the hypoxic control group； the hBMSCs supplemented with 100 ng/mL human NT-3 recombinant protein composed the NT -3 group； the rBMSCs with MK2206， added to the NT -3 group composed the Akt inhibitor group； the rBMSCs cultured with normal oxygen concentration as the normoxic control group， each group was subjected to osteogenic induction for 21 days. The MTT， Western blot， and ELISA assay was used to detect the cell proliferation， apoptosis， and the expression of VEGF and BMP-1 in each group， respectively. Results The OD value of hBMSC proliferation in NT-3 group was significantly higher than that in hypoxia control group（1.438 ± 0.116），The difference was statisically significant（P<0.01）， and the levels of VEGF and BMP-1 protein in NT-3 group（1.704±0.132）ng/mL；（1.794±0.098）ng/mL were higher than those in hypoxia control group，The difference was statisically significant（P<0.01）. Compared with NT-3 group， OD value of hBMSC proliferation decreased （0.927±0.103） in Akt inhibitor group，The difference was statisically significant（P<0.01）， and the levels of VEGF and BMP-1 in Akt inhibitor group Protein content （1.428±0.205）ng/mL；（1.157±0.102）ng/mL was lower than NT-3 group，The difference was statisically significant（P<0.01）. Conclusion NT-3 can improve the anti hypoxia function of hBMSC and promote the proliferation of hBMSC into osteoblasts under hypoxia.

[Key words] Neurotrophin-3 （NT-3）； Bone marrow mesenchymal stem cell （hBMSC）； Prolifertaion； Hypoxia

目前，来源于骨髓的间充质干细胞（Mesenchymal stem cell， MSC）因具备取材方便、免疫原性低、易在体外培养增殖和多向分化等优势已成为组织工程治疗骨折、骨缺损等骨损伤疾病的首选种子细胞[1]。然而，骨损伤部位的持续缺血缺氧环境会减少MSC的存活时间、抑制MSC的增殖和分化能力，从而降低细胞的组织修复功能[2]。因此，提高MSC抗缺氧能力，将对组织工程利用MSC治疗骨损伤具有重要意义。作为骨组织工程的三个关键因素之一，生物活性因子常被用以参与调节成骨的多种因子表达以及成骨细胞的活性来提高成骨效能。神经营养因子-3（Neurotrophin-3， NT-3）由中枢神经系统和肌肉组织产生，具有促进神经和血管再生的功能[3]。近来发现，NT-3在调节MSC增殖和成骨分化等方面具有积极作用[4]。但是，有关NT-3在低氧环境中调节MSC增殖的研究却鲜有报道。有研究发现，在缺氧状态下，缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible Factor-1， HIF-1）会激活氧调节基因NTRK2，促使神经营养因子受体TrkB高表达，进而促进BDNF、NT-3、NT-4等神经营养因子水平升高[5]。这提示应用NT-3可能会发挥保护MSC抗低氧的作用。该实验拟在低氧环境中阐明NT-3在成骨诱导21 d中对hBMSC生长及分化能力的影响，为组织工程治疗骨损伤提供奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

人骨髓间充质干细胞（HUXMA-01101）。α-MEM培养基（SH30265.01B）、胎牛血清（FBS）（SH30071.03）、磷酸盐缓冲液（PBS）（SH30256.01B）。L-谷氨酰胺（G8540-100G）、青霉素（K0035）、链霉素（K0035）、地塞米松（50-02-2）、抗壞血酸（PV0001）、-甘油磷酸钠（50020）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）（M-0283）、二甲基亚砜（DMSO）（D2650）。MK2206（S1078 e3-L1200-02）。人神经营养因子-3（Neurotrophin-3， NT-3）重组蛋白（YB-1294）。人血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF）（KHG0111）、骨形态发生蛋白-1（Bone morphogenetic protein-1， BMP-1）（xyA653Hu）的酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒。胰蛋白酶-EDTA（25300062）。小鼠抗人Caspase-3抗体（ab13586）（1：150）、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG（ab20043）、-actin（ab8227）。RIPA细胞裂解液（P0013B）。Emax 酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与实验分组 hBMSC以含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、1 μmol/L青霉素和100 μ/mL链霉素的α-MEM基本培养基培养。在α-MEM基本培养基中添加100 μmmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗坏血酸C和10 mmol/L β- 甘油磷酸钠则为成骨诱导培养基。

以5% CO2、94% N2 和 1% O2的三气体系建立低氧体外细胞培养模型，在低氧环境下，未行任何添加的hBMSC为低氧对照组；用100 ng/mL人NT-3 重组蛋白作用的hBMSC为NT-3组；先以50 μmol/L MK2206作用30 min，0.01 mmol/L PBS清洗3次，再以100 ng/mL NT-3刺激的hBMSC为Akt抑制剂组；在95%空气和 5% CO2的条件下培养的hBMSC为常氧对照组。各组均行成骨诱导实验3周，结束后行如下实验。

1.2.2 噻唑蓝（MTT）细胞增殖实验 根据实验分组情况，在96孔板中按1×104/孔接种各组细胞，继续在各组实验环境下培养24 h后，加入20 μL的5%MTT孵育4 h，然后添加100 μL DMSO，振荡10 min，Emax酶标仪在490 nm波长检测各组样品吸光度值（OD值）。

1.2.3 Western bolt检测Caspase-3蛋白 取5×106各组实验细胞，进行细胞裂解，在4 ℃下 离心 10 min（12 000 r/min）后，提取蛋白液并测定蛋白浓度。将25 μg各组蛋白样品经SDS-PAGE 凝胶电泳 90 min （100 V）后转至至硝酸纤维素薄膜 （300 mA，40 min），封闭60 min，依次添加一抗小鼠抗人Caspase-3 抗体（1∶150）和二抗HRP标记山羊抗小鼠IgG；室温条件下培育90 min后洗膜，使用增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）检测蛋白表达，Image-Pro Plus 6.0.1软件分析各蛋白条带相对吸光度值作定量计算。β-actin作为内参对照组。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA） 按照实验分组，培养5×106各组细胞，用含1%FBS的α-MEM培养基继续在各组实验条件下培养24 h后，提取各组样品上清液，抽滤，使用ELISA试剂盒检测各组细胞中VEGF、BMP-1蛋白的表达，实验步骤严格按照说明书操作。

1.3 统计方法

各实验均至少重复3次，采用SPSS 19.0统计学软件对实验数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，进行t检验或F检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组细胞增殖检测结果

通过方差分析发现，常氧对照组、低氧对照组、NT-3组和Akt抑制剂组的hBMSC增殖OD值的差异有统计学意义（P<0.01）。低氧环境下，与低氧对照组相比，NT-3组的hBMSC增殖OD值显著增高，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。相较于NT-3组，Akt抑制剂组的hBMSC增殖OD值明显降低，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。比较结果详见表1。

2.2 各实验组细胞凋亡检测结果

实验结果发现，低氧对照组的Caspase-3蛋白含量明显低于常氧对照组组，经方差分析，两者差异有统计学意义（P<0.01）。在低氧环境下，NT-3组的Caspase-3蛋白含量显著高于低氧对照组，经方差分析，两者差异有统计学意义（P<0.01）。Akt抑制剂组的Caspase-3蛋白含量明显低于NT-3组，经方差分析，两者差异有统计学意义（P<0.01）。比较结果详见表2。

2.3 各实验组VEGF和BMP-1蛋白检测结果

经方差分析，发现常氧对照组、低氧对照组、NT-3组和Akt抑制剂组的VEGF和BMP-1蛋白浓度间的差异均有统计学意义（P<0.01）。低氧环境下，相对于低氧对照组，NT-3组的EGF和BMP-1蛋白浓度均明显增高，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。与NT-3组比较，Akt抑制剂组的VEGF和BMP-1蛋白浓度均明显降低，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。比较结果详见表3。

3 讨论

在骨折、骨缺损等骨损伤疾病中，受损区域常因血管和神经的缺失导致局部组织微环境出现严重的缺血缺氧，从而引起骨延迟愈合，骨不连等一系列并发症发生[6]。持续的缺氧环境会破坏细胞的内质网、高尔基复合体等细胞内结构，从而降低细胞生物活性，影响细胞的增殖和分化[7]。因此，纠正缺氧损伤一直是组织工程应用MSC疗法治疗骨损伤的研究热点。

研究发现，组织微环境的氧浓度对细胞的生物活性影响显著。由于人体骨髓内的氧分压为2%～7%，是MSC正常的生理氧环境，加之骨损伤部位的氧分压低于1%等原因，于是有学者提出对MSC进行低氧预处理可提高其在移植区域内的增殖能力[8]。但是，由于受损骨质周围缺乏血管营养和神经支配，持续的缺氧状态会抑制MSC的成骨分化能力[9]。因此设想，如果既能保护MSC抗缺氧损伤，又能促进血管和神经再生，将对促进骨质修复、缩短治疗进程具有重要意义。

近年来，NT-3因具有支持神经元存活、再生、促进神经元功能恢复能等特点已被组织工程广泛应用于神经系统的损伤治疗[10]。同时，有学者发现NT-3在促进血管新生方面也发挥积极作用[10]。前期研究发现，NT-3在高糖环境下可有效促进MSC分化为血管内皮细胞，加快糖尿病性皮肤溃疡愈合[11]。结合Zhang等人[12]的研究，认为NT-3可能在低氧环境中对MSC的增殖具有促进作用。

在该实验中，模拟受损骨质的氧分压环境，利用5% CO2、94% N2 和 1% O2的三气培养体系对细胞进行培养，发现低氧对照组的hBMSC增殖OD值（0.536±0.145）显著低于常氧对照组（1.837±0.104），且凋亡率升高（2.607±0.131），证实了细胞的增殖与分化功能在低氧环境中会受到抑制，并与高文魁等人[13]发现的在5% CO2、92% N2 和 3% O2的低氧环境下。低氧组成骨细胞的增殖OD值（0.405±0.008）低于常氧组成骨细胞的增殖OD值（0.859±0.012）的结果类似，说明我们成功地建立了低氧体外细胞培养模型。

通过实验发现，NT-3组的hBMSC增殖OD值（1.438±0.116）显著高于低氧对照组（0.536±0.145）和Akt抑制剂组（0.927±0.103），凋亡率（1.537±0.116）低于低氧对照组（2.607±0.131）和Akt抑制剂组（1.846±0.109），可能是在低氧环境中，缺氧诱导因子HIF-1激活了细胞表面的Trk受体，进而激活Akt通路促进细胞增殖[14]。Stegeman等人[15]的研究也发现HIF-1会激活Akt通路，从而促进头颈部鳞状癌细胞的增殖。Akt通路在MSC增殖和分化過程中发挥重要作用，我们在前期研究中证实了NT-3可激活Akt通路促进MSC增殖[12]。当然，也不排除在低氧环境中，Akt与PI3K、Erk、Wnt等通路也存在相互作用[16]。虽然有人认为低氧环境也会促进MSC增殖[9]，但实验充分证实了NT-3对MSC成骨分化的促进作用。VEGF是MSC分泌的重要细胞因子之一，它不仅能促进血管新生，还能促进MSC增殖和分化[17]。实验发现，NT-3组的VEGF蛋白浓度（1.704±0.132）ng/mL均高于低氧对照组（0.827±0.140）ng/mL和Akt抑制剂组（1.428±0.205）ng/mL，间接证明了NT-3对MSC的增殖作用。同时，作为检测MSC成骨分化的重要指标，发现NT-3组的BMP-1浓度（1.794±0.098）ng/mL显著高于低氧对照组（0.957±0.115）ng/mL和Akt抑制剂组（1.157±0.102）ng/mL，这也证明了NT-3不但能促进MSC增殖，还能在低氧环境下促进MSC成骨分化。

综上所述，NT-3在低氧环境下能有效促进MSC增殖与分化，在促进血管和神经再生的同时，能够发挥抗缺氧因子的功能。下一步，将着重研究NT-3在生物支架材料中的缓释功能，通过对应用间充质干细胞组织工程技术促进移植物血管化，加速骨缺损的修复。

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（收稿日期：2017-11-22）