循环水养殖系统中好氧反硝化细菌的分离和应用❋

陈 钊， 宋协法， 黄志涛， 李 健， 董登攀， 任 义， 江玉立

(1.中国海洋大学水产学院，山东 青岛266003；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所, 山东 青岛 266071)

脱氮技术是水质净化、污水处理的重要手段，其中生物脱氮技术因不需要后续处理、无副产物产生而成为最经济的脱氮方法[13]。生物脱氮技术有着广泛的应用，其在循环水养殖系统中对于水质的控制发挥着重要作用，其中氨氮和亚硝酸盐因对养殖生物具有毒性而受到严格控制，一般是利用生物滤池中硝化细菌的硝化作用将氨氮和亚硝酸盐转化为低毒性的硝酸盐，但硝酸盐的持续积累最终也会导致系统的崩溃，所以将硝酸盐通过反硝化作用转化为气态氮，完成氮元素由水域向大气的转移仍然是必要的过程。循环水养殖系统内需要高溶氧以确保其高密度养殖的需求，而传统的反硝化过程是在厌氧的环境下进行的[1]，这与循环水养殖的要求相矛盾，需要额外增加水处理环节以实现厌氧反硝化。厌氧反硝化会增加养殖成本、限制循环水养殖系统的生产，所以好氧反硝化的发现从根本上解决了这一矛盾。针对循环水养殖的特点开展好氧反硝化的相关研究，对于循环水养殖系统的脱氮、维持良好的水质状态具有重要意义。

生物滤池具有十分复杂的生态结构，在实现循环水养殖系统脱氮、控制养殖系统水质方面起着至关重要的作用。本研究尝试从循环水养殖系统中的生物滤池内分离好氧反硝化细菌，开展相关研究，并在此基础上进行好氧反硝化反应器的应用研究，以期为循环水养殖系统的脱氮技术工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 细菌分离

1.1.1 样品来源 莱州明波公司珍珠龙胆(♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatu)循环水养殖系统内的生物滤池。

1.1.2 培养基及试剂 反硝化富集培养基[14]：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，KNO31.0 g，人工海水(30 ‰的NaCl溶液)1 000 mL，pH≈7.4。

溴百里酚蓝(BTB)分离培养基[15]：KNO31.0 g，C6H5Na3O2·2H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，溴百里酚蓝(1 %溶于酒精)1 mL，琼脂 20.0 g，人工海水1 000 mL，pH=7.2。

活化培养基：KNO31.0 g，C6H5Na3O2·2H2O 1.0 g，KH2PO41.0 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，CaCl20.2 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，人工海水1 000 mL，pH≈7.4。

反硝化性能测定培养基(DM)：C6H5Na3O2·2H2O 1.31 g，CH3COONa 1.10 g，KNO30.361 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO41.0 g，K2HPO45.0 g，NaCl 0.5 g，微量元素溶液1 mL，人工海水999 mL，pH≈7.4。

微量元素溶液[16]：EDTA 50.0 g，ZnSO42.2 g，CaCl25.5 g，MnCl2·4H2O 5.06 g，FeSO4·7H2O 5.0 g，(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，去离子水1 L，pH= 7.0。

各培养基用前都在121 ℃条件下灭菌20 min。

1.1.3 细菌富集 将从生物滤池中获取的滤料在无菌环境下剪碎后放入装有90 mL无菌人工海水的三角瓶中，在摇床200 r/min条件下震荡3 h。随后取上清液10 mL接种到90 mL富集培养基中，并于30 ℃、转速150 r/min条件下培养，每隔12 h分别用二苯胺试剂和格里斯试剂定性检验硝酸盐和亚硝酸盐含量，当硝酸盐明显降低且有亚硝酸盐产生时富集下一代。如此重复富集3次获得四代富集培养液。

1.1.4 细菌分离纯化及鉴定 用无菌人工海水将四代富集培养液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-88个梯度，分别移取0.1 mL稀释液在BTB平板上稀释涂布，每个梯度做2个平行，之后在30 ℃恒温箱中培养2～3 d，待菌落长出后，选取变蓝的平板并挑取带蓝色晕圈的单菌落再次划线(每代皆做2个平行)，如此纯化3次获得四代纯化菌落。将菌落一致、生长良好的平板上的菌株接种到斜面培养基上，4 ℃保藏。

提取菌株DNA进行16S rDNA序列分析，将测序结果与Genbank数据库进行Blast分析确定菌株种类。

1.2 反硝化性能测定

用接种环从斜面培养基上刮取适量细菌接种到装有100 mL活化培养基的三角瓶内，30 ℃、180 r/min条件下活化2天。移取2 mL活化培养液接种到100 mL反硝化测定培养基中，30 ℃、180 r/min条件下培养，分别测定其48 h后的硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮的浓度变化。

1.3 反硝化反应器的运行与控制

1.3.1 实验装置 如图1所示，人工污水通过蠕动泵以恒定流速(12.22 mL/min)由反应器底部入水口输送进反应器，然后从反应器上部出水口流出，进入废液缸，不再利用。反应器内填充190 g K1滤料，滤料为直径1 cm、高1 cm的内十字圆筒结构，外壁附有纵向突起条带；滤料密度约为0.96 g/cm3(堆积密度150 kg/m3)，比表面积约850 m2/m3。反应器有效水容积为2.2 L，水力停留时间(HRT)为3 h。反应器浸入配有加热棒的水槽中施行水浴控温(水槽内持续充气搅拌以实现均匀加热)，温度控制在(25+1)℃；反应器外壁贴有黑色壁纸以避光；24 h充气。

图1 实验装置图Fig. 1 The figure of experimental apparatus

1.3.3 接种 将分离、筛选的菌株分别在25 ℃、180 r/min条件下单独活化2天。移取每种菌的活化培养液(约3×1010CFU/mL)10 mL到装有2.2 L人工污水的反硝化反应器中混合接种，24 h充气，蠕动泵不启动，稳定2天。

1.3.4 水质监测 在接种后的48 h中，每隔12 h对反应器内的水质进行取样分析，检测硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮、总氮的浓度变化。接种2天后开启蠕动泵，每天从反应器的进出水口取样分析，检测上述4个指标的变化，直至出水口水质达到稳定。

1.4 水质分析方法

氨氮检测方法为次溴酸盐氧化分光光度法，亚硝酸盐的检测方法为N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，硝酸盐检测方法为锌镉还原法，总氮检测方法为过硫酸钾氧化-紫外分光光度法。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

细菌富集阶段，经二苯胺和格里斯试剂定性检测，12 h后即有亚硝酸盐的产生，24 h后硝酸盐的含量明显降低。48 h后进行下一代富集。涂布平板后，10-3、10-4和10-53个稀释度平板上的菌落有利于单菌落的挑取，选取此3个稀释度平板进行下一代的纯化；重复划线，获得四代纯化菌株。最终分离出8株细菌，分别命名为Z1～Z8。

结合细菌反硝化性能测定结果，选择Z1、Z8 2株脱氮效果较好的细菌进行16S rDNA鉴定，结果显示Z1、Z8分别与弧菌属(Vibrio)的V.neocaledonicus和V.azureus相似度最高，同源性均达99%以上(Genbank序列登录号分别为KX037098、KX037099)。

2.2 细菌反硝化性能测定

图2显示，各菌株硝酸盐去除率都较高，但都存在一定的亚硝酸盐和氨氮积累。Z1、Z2、Z3、Z4、Z8菌株亚硝酸盐、氨氮积累较少，硝酸盐去除率90%左右、无机氮去除率87 %左右，效果良好；Z5、Z6、Z7亚硝酸盐、氨氮积累比较严重，且硝酸盐和无机氮去除率相对较低。

图2 48 h反硝化性能测定结果Fig. 2 The results of 48h denitrification test

2.3 反硝化反应器的脱氮效果

2.3.1 接种后48 h反应器内水质变化 将分离、筛选菌株Z1、Z8各自活化后混合接种入反应器。反应器接种后保持24 h充气，每隔12 h对反应器内污水进行取样分析，检测硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮和总氮的变化，结果如图3所示，相应硝酸盐和总氮的去除率见图4。

图3 反应器接种后48 h内水质变化Fig. 3 The changes of water quality in the bioreactor during the 48 h after inoculation

图4 反应器接种后48 h内硝酸盐和总氮去除率变化 Fig. 4 The changes of nitrate and total nitrogen removal rates in the bioreactor during the 48 h after inoculation

由图3和4可知，48 h内硝酸盐的浓度大幅降低，最终去除率为56.26 %，但从误差线幅度可知，3个反应器之间差异较大；总氮去除效果微弱，48 h总氮去除率13.98 %；亚硝酸盐存在显著积累现象，且积累速率较快，12 h达到峰值(10.88 mg/L)后开始缓慢降低，并有趋于稳定的趋势；氨氮也存在积累现象，最终浓度达到6.87 mg/L。

图5 生物反应器进出水口亚硝酸盐变化Fig. 5 Nitrite concentrations change of inlet and outlet water from the bioreactor

图6 生物反应器进出水口氨氮变化Fig. 6 Ammonia concentrations change of inlet and outlet water from the bioreactor

图7 生物反应器进出水口硝酸盐变化Fig. 7 Nitrate concentrations change of inlet and outlet water from the bioreactor

图8 生物反应器进出水口总氮变化

图9 生物反应器对硝酸盐和总氮的去除率Fig. 9 Nitrate and total nitrogen removal rates of the bioreactor

系统启动一天后，亚硝酸盐积累十分严重，达到37.41 mg/L，说明反硝化过程的的第一阶段十分活跃，大量硝酸盐被还原为亚硝酸盐；之后亚硝酸盐浓度迅速降低，最低浓度为0 mg/L(第14天)，在经历2次波动之后，逐渐趋于稳定，实验结束时亚硝酸盐浓度为0.18 mg/L。与反应器接种后48h相比，系统启动后氨氮积累情况大幅减弱，第一天氨氮浓度为0.69 mg/L，之后出现多次波动，第7天达到峰值2.75 mg/L，最低浓度为0.04 mg/L(第13天)，20 d后逐渐趋于稳定，实验结束时氨氮浓度为0 mg/L。反应器对硝酸盐的去除效率非常高，系统启动后第一天去除率即达到79.04 %，此后历经几次起伏；9天后达到理想状态，除第18～20天去除率在95 %左右，其它时间硝酸盐去除率都在98 %以上。总氮在系统启动初去除效果较弱，第一天去除率只有20.94 %，此后迅速提升，第3天即达到去除率峰值83.17 %，此后历经多次波动，慢慢趋于稳定，实验结束时总氮去除率为74.40 %。总体来看，反硝化反应器对人工污水的脱氮效果良好，硝酸盐及总氮去除效果理想，氨氮和亚硝酸盐积累情况在后期稳定后较弱，具有一定的应用价值。

3 讨论

Vibrioneocaledonicus、Vibrioazureus都属于变形菌门(Proteobacteria)伽马变形菌纲(r-Proteobacteria)弧菌目(Vibrionales)弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属(Vibrio)；Vibrioneocaledonicus是Chalkiadakis[20]等学者于2013年发现的一株细菌，具有将硝酸盐转化为亚硝酸盐的代谢特性；Vibrioazureus是Yoshizawa等学者[21]2009年发现的一株细菌，同样具有将硝酸盐转化为亚硝酸盐的能力。好氧反硝化细菌一般存在于假单胞菌属(Pseudomonas)；产碱杆菌属(Alcaligenes)；副球菌属(Paracoccus)；芽孢杆菌属(Bacillus)等[3]，但弧菌属好氧反硝化细菌鲜有报道。

实验期间生物反应器出水口水质出现多次波动，而且从对应时间的误差线幅度也可以看出3个反应器在波动期会出现较大差异。反硝化细菌属于异养微生物，而人工污水C/N较高，营养物质丰富，利于微生物的繁殖；另一方面，反应器直接暴露在室内，自然环境中的微生物也会在其中大量繁殖，使得反应器内的群落结构变得十分复杂，再加上反应器容积太小，很容易受到外界环境的影响。实验期间观察到反应器内滤料表面生物膜逐渐增多，后期滤料表面附着了大量生物膜，微生物生命周期短，大量死亡后可能导致水质恶化，引起水质波动。

4 结语

参考文献：

[1] Ferguson S J. Denitrification and its control[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1994, 66(1-3): 89-110.

[2] Frette L, Gejlsbjerg B, Westermann P. Aerobic denitrifiers isolated from an alternating activated sludge system[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1997, 24(4): 363-370.

[3] 王薇, 蔡祖聪, 钟文辉, 等. 好氧反硝化菌的研究进展[J]. 应用生态学报, 2008, 18(11): 2618-2625.

Wang W, Cai Z C, Zhong W H, et al. Research advances in aerobic denitrifiers[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 18(11): 2618-2625.

[4] Lukow T, Diekmann H. Aerobic denitrification by a newly isolated heterotrophic bacterium strain TL1[J]. Biotechnology Letters, 1997, 19(11): 1157-1159.

[5] Robertson L A, Kuenen J G. Aerobic denitrification: A controversy revived[J]. Archives of Microbiology, 1984, 139(4): 351-354.

[6] Chen F, Xia Q, Ju L K. Aerobic denitrification ofPseudomonasaeruginosamonitored by online NAD (P) H fluorescence[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(11): 6715-6722.

[7] Kim M, Jeong S Y, Yoon S J, et al. Aerobic denitrification ofPseudomonasputidaAD-21 at different C/N ratios[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 106(5): 498-502.

[8] Wang P, Yuan Y, Li Q, et al. Isolation and immobilization of new aerobic denitrifying bacteria[J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2013, 76: 12-17.

[9] Ji B, Wang H, Yang K. Nitrate and COD removal in an upflow biofilter under an aerobic atmosphere[J]. Bioresource Technology, 2014, 158: 156-160.

[10] Huang H K, Tseng S K. Nitrate reduction byCitrobacterdiversusunder aerobic environment[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 55(1): 90-94.

[11] Chen F, Xia Q, Ju L K. Competition between oxygen and nitrate respirations in continuous culture ofPseudomonasaeruginosaperforming aerobic denitrification[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2006, 93(6): 1069-1078.

[12] 郭焱, 张召基, 陈少华. 好氧反硝化微生物学机理与应用研究进展[J]. 微生物学通报, 2016, 43(11): 2480-2487.

Guo Y, Zhang Z, Chen S. Microbiology and potential application of aerobic denitrification: A review[J]. Microbiology China, 2016, 43(11): 2480-2487.

[13] Liu Y, Gan L, Chen Z, et al. Removal of nitrate usingParacoccussp. YF1 immobilized on bamboo carbon[J]. Journal of Hazardous Materials, 2012, 229: 419-425.

[14] 马放, 任南琪, 杨基先. 污染控制微生物学实验[M]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社, 2002.

Ma F, Ren N Q, Yang J X. Microbiology Experiment of Pollution Control [M]. Harbin: Harbin Institute of Technology Press, 2002.

[15] Takaya N, Catalan-Sakairi M A B, Sakaguchi Y, et al. Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(6): 3152-3157.

[16] Zheng H Y, Liu Y, Gao X Y, et al. Characterization of a marine origin aerobic nitrifying-denitrifying bacterium[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 114(1): 33-37.

[17] 马放, 王弘宇, 周丹丹. 活性污泥体系中好氧反硝化菌的选择与富集[J]. 湖南科技大学学报(自然科学版), 2005, 20(2): 80-83.

Ma F, Wang H Y, Zhou D D. Selection and enrichment of aerobic denitrifier in activated sludge system [J]. Journal of Hunan University of Science and Technology (Natural Science Edition), 2005, 20(2): 80-83.

[18] Meiberg J B M, Bruinenberg P M, Harder W. Effect of dissolved oxygen tension on the metabolism of methylated amines in Hyphomicrobium X in the absence and presence of nitrate: Evidence for 'aerobic' denitrification[J]. Journal of General Microbiology, 1980, 120(2): 453-463.

[19] Kong Q X, Li J W, Wang X W, et al. A new screening method for aerobic denitrification bacteria and isolation of a novel strain[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2005, 11(2): 222-225.

[20] Chalkiadakis E, Dufourcq R, Schmitt S, et al. Partial characterization of an exopolysaccharide secreted by a marine bacterium,Vibrioneocaledonicussp. nov. , from New Caledonia[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 114(6): 1702-1712.

[21] Yoshizawa S, Wada M, Kita-Tsukamoto K, et al. Vibrio azureus sp. nov. , a luminous marine bacterium isolated from seawater[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, 59(7): 1645-1649.

[22] Kucera I, Matyasek R. Aerobic adaptation of Paracoccus denitrificans: Sequential formation of denitrification pathway and changes in continuous culture ofPseudomonasstutter[J]. Appl Environ Microbiol, 1989, 55: 1670-1676.

[23] Körner H, Zumft W G. Expression of denitrification enzymes in response to the dissolved oxygen level and respiratory substrate in continuous culture ofPseudomonasstutzeri[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(7): 1670-1676.

[24] 付昆明, 曹相生, 孟雪征, 等. 污水反硝化过程中亚硝酸盐的积累规律[J]. 环境科学, 2011, 32(6): 1660-1664.

Fu M, Cao X, Meng X, et al. Characteristics of nitrite accumulation during wastewater denitrification[J]. Environmental Science, 2011, 32(6): 1660-1664.

[25] Simon J. Enzymology and bioenergetics of respiratory nitrite ammonification[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2002, 26(3): 285-309.

[26] Bonin P, Omnes P, Chalamet A. Simultaneous occurrence of denitrification and nitrate ammonification in sediments of the French Mediterranean Coast[J]. Hydrobiologia, 1998, 389(1-3): 169-182.

[27] Kelso B, Smith R V, Laughlin R J, et al. Dissimilatory nitrate reduction in anaerobic sediments leading to river nitrite accumulation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(12): 4679-4685.

[28] Yin S X, Chen D, Chen L M, et al. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium and responsible microorganisms in two Chinese and Australian paddy soils[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2002, 34(8): 1131-1137.

[29] Fazzolari é, Nicolardot B, Germon J C. Simultaneous effects of increasing levels of glucose and oxygen partial pressures on denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in repacked soil cores[J]. European Journal of Soil Biology, 1998, 34(1): 47-52.

[30] Polcyn W, Luciński R. Aerobic and anaerobic nitrate and nitrite reduction in free-living cells ofBradyrhizobiumsp. (Lupinus)[J]. FEMS Microbiology Letters, 2003, 226(2): 331-337.

[31] 殷士学. 淹水土壤中硝态氮异化还原成铵过程的研究 [D]. 南京: 南京农业大学, 2000.

Yin S. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in Submerged Soils[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2000.

[32] 陈丽敏. 淹水土壤中反硝化菌和硝酸还原菌数量、生理类群及其还原特点的研究 [D]. 江苏: 扬州大学, 2001.

Chen L. Study on the Pulation, Physiological Groups and Reduction Characteristics of Denitrification Bacteria and Nitrate Reducing Bacteria in Submerged Soil[D]. Jiangsu: Yangzhou University, 2001.

[33] 杨杉, 吴胜军, 蔡延江, 等. 硝态氮异化还原机制及其主导因素研究进展[J]. 生态学报, 2016, 36(5): 1224-1232.

Yang S, Wu S, Cai Y, et al. The synergetic and competitive mechanism and the dominant factors of dissimilatory nitrate reduction processes: A review[J]. Acta Ecologica Sinica, 2016, 36(5): 1224-1232.

[34] 韦宗敏, 黄少斌, 蒋然. 碳源对微生物硝酸盐异化还原成铵过程的影响[J]. 工业安全与环保, 2013, 38(9): 4-7.

Wei Z M, Huang S B, Jiang R. Effect of carbon on dissimilatory nitrate reduction to ammonium process[J]. Industrial Safety and Environmental Protection, 2013, 38(9): 4-7.

[35] Dalsgaard T, Bak F. Nitrate reduction in a sulfate-reducing bacterium,Desulfovibriodesulfuricans, isolated from rice paddy soil: Sulfide inhibition, kinetics, and regulation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1994, 60(1): 291-297.