过敏症状儿童室内PM2.5对小鼠巨噬细胞的氧化损伤及VE的抗氧化保护作用研究

陈业文，胡元灏，程龙，刘俏，晏彪，吴喆

湖北科技学院基础医学研究中心，咸宁 437100

可吸入细颗粒物(PM2.5，空气动力学直径≤2.5 μm)对人体的不利影响主要取决于粒径、成分和浓度，并随季节变化[1]，其浓度的升高与过敏性疾病的发病率有着密切的关系[2-3]。Zhang等[4]对我国4个城市(广州、武汉、兰州、重庆)8 000余名小学生的调查表明，PM2.5浓度每升高39 μg·m-3，儿童哮喘的发病率就会增加1.22%；Chen等[5]应用多重Logistic回归模型分析了我国6个城市(上海、南京、重庆、长沙、乌鲁木齐、太原)30 759名学龄前儿童的过敏症状个体水平，其结果发现，PM2.5年平均浓度每升高10 μg·m-3，过敏性鼻炎(OR=1.2，95%可信区间为1.11～1.29)、哮喘(OR=1.1，95%可信区间1.03～1.18)的患病率呈正相关。大量研究表明，PM2.5暴露对儿童过敏性疾病具有重要影响[2-5]，然而PM2.5与过敏性疾病的关联尚未完全阐明。

已有研究表明，PM2.5能使巨噬细胞功能失调，并最终诱发哮喘和其他过敏性疾病[6]。PM2.5主要通过呼吸道进入体内，那些粒径小于0.1 μm的PM2.5还能直接穿透肺泡进入血液循环系统。巨噬细胞是该系统中重要的一类靶细胞，有研究指出，PM2.5暴露会使肺泡巨噬细胞出现DNA损伤[7]，诱导肺巨噬细胞发生炎症反应[8]；但由于PM2.5的成分复杂，含多种有害物质，加之其暴露毒性可能受多种因素影响，因而其致病机理目前尚无定论[9]。当前，提出的PM2.5的毒性机制较多[10]，主要包括氧化应激，炎症反应以及先天和后天免疫反应，其中氧化应激可能是公认的机制之一，其他机制均与氧化应激相关[11]。PM2.5由于不规则以及多棱角，首先进入体内后，会对呼吸道上皮细胞、肺泡细胞、血管内皮细胞均有直接的机械损伤[12]，在此过程中，PM2.5与细胞作用会诱导机体释放活性氧(ROS)，而ROS的过量产生与呼吸、循环系统的损伤密切相关[13]。

黄虹等[14]利用人体肺部PM浓度模型定量评估了广州市夏、冬季抽样人群PM2.5的日均暴露量发现，冬季的暴露量大于夏季，未成年人接触PM2.5的量要比老年人、成年人高。一些研究也指出，未成年人在室内所处的时间较室外长[15]，而且室内PM2.5的浓度有可能高于室外[16]，因而，室内PM2.5对未成年人尤其是那些患有过敏症状儿童的影响值得关注。本研究从武汉市洪山区的5户患有过敏症状儿童的室内采集PM2.5，通过检测不同剂量PM2.5暴露下小鼠腹腔巨噬细胞的氧化应激水平(ROS、GSH、8-OH-dG)，炎症因子水平(TNF-ɑ、IL-8β)，并同时联合VE进行阻断，以探究其对小鼠巨噬细胞的氧化损伤作用以及VE在此过程中的抗氧化保护作用。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器与试剂

仪器：AirChek XR5000 PM2.5环境采样器(美国SKC)，QMA 石英膜(美国Whatman)，Centrivap®真空离心浓缩仪(美国Labconco)，Power wave XS 酶标仪(美国Bio-Tek)，FLX800荧光酶标仪(美国Bio-Tek)，SW-CJ-2D超净工作台(中国苏州净化)，TE2000-S倒置显微镜(日本Nikon)。

试剂：RPMI 1640 培养基，胎牛血清(Gibco)，二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA，>99.9%，美国Sigma)，硫代巴比妥酸(TBA，分析纯)，还原型谷胱甘肽试剂盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠8-OH-dG、TNF-α 和IL-8β酶联免疫试剂盒(美国eBioscience)，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.1.2 实验动物

选用湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供的SPF级雌性昆明小鼠(6周龄，合格证号：42000600003915)，标准环境(12 h:12 h光照-黑暗循环，50%～70% 湿度，温度为20～25 ℃)饲养1周后取材实验。

1.2 实验方法

1.2.1 PM2.5的采集

本研究先对100余户家庭中10～12岁的儿童进行问卷调查，满足以下条件：儿童居住时间> 3年，且儿童患有1种或1种以上的过敏性症状(如过敏性鼻炎、哮喘)，筛选出5户家庭作为PM2.5采样点。用AirChek XR5000 PM2.5采样器采集，所设置的吸气流量为1.5 L·min-1，2016年10月至12月期间每日白天无间断采样8 h，采样当时监测的室内PM2.5浓度为200～500 μg·m-3，相对湿度范围为55%～70%，室内温度变化范围为17～22 ℃。采集样品在QMA 石英膜(直径46.2 mm)上。

1.2.2 PM2.5悬液制备

QMA石英膜经干燥处理后，将滤膜剪成1～2 cm2的小块，用三蒸水超声振荡20 min，去除滤膜。滤液混匀，再经真空离心浓缩仪处理，称重后，用PBS配成所需浓度，混匀并灭菌，4 ℃保存。实验时超声震荡15 min混匀使用。

1.2.3 巨噬细胞的分离和培养

雌性SPF级KM小鼠实验前3 d，腹腔注射1 mL 6%可溶性淀粉(可刺激小鼠腹腔产生更多的巨噬细胞)后，按李海涛等[17]的操作步骤获得巨噬细胞，经HE染色鉴定为巨噬细胞，同时用0.4%台盼蓝(Trypan blue，实验室常用活体染色剂)染色巨噬细胞5 min，分别3次计数视野内100个细胞中出现蓝色细胞的比例，取平均值，巨噬细胞的存活率=1-(4+5+5)/(100×3)=95.3 %。经鉴定后分离出的细胞先铺板于6孔板2 h后，洗去未贴壁细胞，待细胞计数后调整细胞密度为l×l09个·L-1，移入96孔板中，每孔180 μL，混匀后置于培养箱中待染毒。

1.2.4 PM2.5暴露浓度的选择与分组

PM2.5与巨噬细胞共培养24 h。PM2.5浓度参考先前的研究[18]选择为0(对照)，10 μg·mL-1(低剂量)，200 μg·mL-1(高剂量)；50 mg·mL-1的VE作为非酶抗氧化剂。实验分组如下：(A) 对照组(control, saline)，(B)患过敏症状儿童的室内(indoor allergic)10 μg·mL-1PM2.5，(C) 患过敏症状儿童的室内(indoor allergic)200 μg·mL-1PM2.5；(D) VE(50 mg·mL-1)；(E)VE(50 mg·mL-1)+患过敏症状儿童的室内(indoor allergic)200 μg·mL-1PM2.5。

1.2.5 指标测定

(1)ROS测定：2’,7’-二氯荧光素二乙酸(DCF)被广泛用于检测活性氧的生成，用以评估整个氧化应激的潜在毒性[19]。DCFH-DA能穿透细胞膜并被细胞内的水解酯酶分解产生非荧光的DCFH。ROS含量通过监测这种荧光变化来衡量，具体方法参考文献[20]。最终的反应混合物置于黑暗环境下5 min，然后选择激发波长485 nm和发射波长520 nm，用FLx800荧光酶标仪检测。

(2)GSH测定：谷胱甘肽可以在黑暗中与二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)反应形成黄色化合物，GSH试剂盒可用来检测这种颜色变化。然后用酶标仪检测412 nm 波长下吸光值，根据标准曲线，计算GSH含量(μmol·mL-1)= OD412/0.0023,R2=0.997。

(3)MDA测定：MDA可与TBA反应形成稳定的发色团，实验方法简言之，2 mL 0.6% TBA溶解液(10% TCA助溶)与0.5 mL细胞悬液混合，沸水浴15 min，会有粉红色混合物沉淀生成。随后快速冷却，10 000 g离心5 min，收集的上清液，用酶标仪检测450、532、600 nm 波长下吸光值，MDA 含量(μmol·mL-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。

(4)DNA损伤分析：暴露后的细胞上清液中所含的8-OH-dG含量使用ELISA试剂盒测定，试剂盒敏感度为0.5 ng·mL-1。

(5)TNF-α和IL-8β的检测：本实验中巨噬细胞上清液中TNF-α 和IL-8β的含量通过ELISA试剂盒检测，TNF-α、IL-8β试剂盒灵敏度都为8.0 pg·mL-1。

1.2.6 统计学分析

数据采用平均值(mean)±标准差(SEM)。组间的差异分析通过单向方差分析(ANOVA)结合t检验(Tukey test)确定，P< 0.05、P< 0.01为差异显著。统计图表使用GraphPad Prism 5.0软件绘图。

2 结果(Results)

2.1 PM2.5影响小鼠腹腔巨噬细胞的形态

图1显示PM2.5暴露24 h后小鼠腹腔巨噬细胞的形态变化，对照组的巨噬细胞呈圆型或椭圆(图1A)，有伪足状突起，而PM2.5暴露组的巨噬细胞伪足状突起消失或并不明显(图1B、1C)；且随着PM2.5浓度的增大，核质比明显增大(图1B、1C)。从图1E可以看出，与200 μg·mL-1PM2.5组比较，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5组虽有一定程度的皱缩，但巨噬细胞的数量明显较多。

图1 PM2.5暴露24 h后巨噬细胞的形态图(Giemsa染色，×20)注：(A)对照组(control, saline)，(B)患过敏症状儿童的室内(indoor allergic)10 μg·mL-1 PM2.5，(C)患过敏症状儿童的室内(indoor allergic)200 μg·mL-1 PM2.5；(D)VE(50 mg·mL-1)；(E)VE(50 mg·mL-1)+患过敏症状儿童的室内(indoor allergic)200 μg·mL-1 PM2.5。Fig. 1 Morphology of macrophages after exposure to PM2.5 for 24 h (stained with Giemsa, ×20 magnification)Note: (A) Control (saline); (B) allergic 10 μg·mL-1 PM2.5; (C) allergic 200 μg·mL-1 PM2.5; (D) VE (50 mg·mL-1); (E) VE (50 mg·mL-1) + allergic 200 μg·mL-1 PM2.5.

图2 PM2.5对小鼠巨噬细胞ROS的影响 (n = 5)注：与对照组比较，**P < 0.01；与混合组(PM2.5+ VE)比较，# # P< 0.01。Fig. 2 ROS level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n=5)Note: **P< 0.01, compared with control; # # P< 0.01, VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1 PM2.5 group compared with 200 μg·mL-1 PM2.5 group.

图3 PM2.5对小鼠巨噬细胞GSH的影响(n = 5)注：与对照组相比，**P< 0.01。Fig. 3 GSH level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n=5)Note: ** P< 0.01, compared with control.

2.2 PM2.5诱导ROS生成和GSH衰减

ROS是氧化应激最重要的生物标志物，而GSH是氧化应激过程中的清除剂，可以清除活性氧分子(如·OH等)，防止氧化，但自身也会随之被消耗。细胞内PM2.5诱导ROS生成的结果如图2所示，ROS水平在PM2.5暴露24 h后增加非常显著(P< 0.01)。与200 μg·mL-1PM2.5组比较，VE (50 mg·mL-1) + allergic 200 μg·mL-1PM2.5组ROS含量下降，差异有统计学意义(P< 0.01)。从图3可以看出，与对照组比较，200 μg·mL-1PM2.5组GSH含量明显降低，差异有统计学意义(P< 0.01)；与200 μg·mL-1PM2.5组比较，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5组GSH含量升高。

2.3 PM2.5诱导脂质过氧化

ROS过量诱导的另一个主要结果是会导致脂质过氧化反应，而脂质过氧化会进一步损伤细胞。MDA是脂质过氧化的终产物，因而MDA浓度的变化可以指示脂质过氧化的损伤程度。从图4可以看出，10 μg·mL-1和200 μg·mL-1PM2.5组的MDA水平增加显著(P< 0.01)。与200 μg·mL-1PM2.5组比较，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5组MDA含量下降，差异有统计学意义(P< 0.01)。

2.4 PM2.5诱导DNA损伤

8-OH-dG作为DNA氧化损伤的敏感指标，可用来反映PM2.5诱导DNA损伤的程度。如图5所示，与对照组比较，200 μg·mL-1PM2.5组的8-OH-dG水平增加，差异有统计学意义(P< 0.05)。

2.5 PM2.5诱导炎症因子释放

TNF-α和IL-8β，是2种非常重要的炎症因子，通过检测它们含量的变化可以间接评估PM2.5对巨噬细胞炎症反应的影响。TNF-α的结果如图6所示，与对照组比较，200 μg·mL-1PM2.5组的有显著差异(P< 0.01)，与200 μg·mL-1PM2.5组比较，VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1PM2.5组TNF-α水平有降低的趋势。IL-8β的结果如图7所示，该结果显示的趋势与TNF-α的相同，即与对照组相比，200 μg·mL-1PM2.5组的发生了显著变化(P< 0.05)。

图4 PM2.5对巨噬细胞MDA的影响(n = 5)注：与对照组比较，**P< 0.01；与混合组(PM2.5+ VE)比较，# # P< 0.01。Fig. 4 MDA level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n=5)Note: **P< 0.01, compared with control; # #P< 0.01, VE (50 mg·mL-1) + 200 μg·mL-1 PM2.5 group compared with 200 μg·mL-1 PM2.5 group.

图5 PM2.5对巨噬细胞8-OH-dG的影响 (n=5)注：与对照组相比，* P< 0.05。Fig. 5 8-OH-dG level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n = 5)Note: *P< 0.05, compared with control.

图6 PM2.5对巨噬细胞TNF-α的影响(n = 5)注：与对照组相比， ** P< 0.01。Fig. 6 TNF-α level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n = 5)Note: ** P< 0.01, compared with control.

图7 PM2.5对巨噬细胞IL-8β的影响 (n = 5)注：与对照组相比，*P< 0.05。Fig. 7 IL-8β level of macrophages induced by different concentrations of PM2.5 after 24 h (n = 5)Note:* P< 0.05, compared with control.

3 讨论(Discussion)

近些年国外的权威研究调查表明[21]，主要空气污染物包括PM2.5与儿童过敏性疾病之间存在着一定的联系：过敏性症状与PM2.5的暴露程度有关[22]。Rojasbracho等[23]的研究表明，室内PM2.5浓度与个人行为显著相关，更高的污染风险可能对个体健康产生较为严重的影响。根据本实验结果，暴露于更高水平的室内PM2.5有可能会增加细胞损伤的风险。细胞形态学结果显示，小鼠腹腔巨噬细胞的数量会随着PM2.5暴露浓度的增加而降低，其多伪足状突起的形态特征逐渐消失。PM2.5暴露剂量由10 μg·mL-1增加到200 μg·mL-1，反映氧化应激和炎症反应的指标也均表现出一定的剂量依赖关系，随着ROS含量的累积，还原性GSH的含量相应地损耗，脂质过氧化产物MDA含量增加，8-OH-dG水平增加，IL-8、TNF-α的表达量增加。

研究表明，通过氧化应激介导的炎症反应可能是PM2.5潜在毒性的致病机制之一[11]。有研究指出，PM2.5自身含有大量的半醌类自由基，且这些自由基通过激活ROS聚集对DNA造成损伤[24]。ROS可以由细胞接触PM2.5后直接通过氧化还原生成，也可以间接通过细胞与PM2.5交互作用生成[11]。细胞受到外来异物PM2.5刺激后，伴随ROS的积累，细胞会出现不同程度的损伤，机体随之会作出即时的反应，激活免疫细胞(如巨噬细胞)释放出大量的促炎症细胞因子，如IL-8、TNF-α[25]。这些细胞因子的及时分泌对机体免受PM2.5伤害是有利的，然而，长期的炎症反应则相当不利，如：低浓度TNF-α对机体的自我平衡功能(如组织修复、启动凋亡)是重要的，而其整体水平随炎症的增强而增强，TNF-α的过剩则可能会导致严重的组织损伤[26]。许多呼吸道疾病(哮喘、慢性阻塞性肺病)可以追溯到炎症相关细胞因子高水平的活化[27]，氧化应激过程通过协同作用能有效激活促炎症因子(如IL-8、TNF-α等)的表达，涉及的信号通路主要有激活氧化还原致敏因子的蛋白激酶(MAPK)途径和核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)途径[28]。如：在呼吸系统疾病(如慢性呼吸疾病和哮喘)中，PM2.5能通过核转录因子依赖(NF-κB-dependent)途径、核转录因子抑制(IκB-independent)途径促进IL-8的释放[11]。

本研究显示，较高剂量(≥200 μg·mL-1)PM2.5暴露后的小鼠巨噬细胞出现氧化损伤，并伴有炎症反应；VE在该应激过程中起着一定的保护作用。虽然实验小鼠与人体存在差异，但结果仍有一定参考价值；由于PM2.5的复杂性，其造成损伤的机制有待进一步研究。

通讯作者简介：晏彪(1988-)，男，硕士，助教，主要从事环境医学和环境毒理学方面的研究。

共同通讯作者简介：吴喆(1983-)，女，硕士，讲师，主要研究方向为基础医学。

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