百香柿子果醋饮料的研制

王从从，石磊，万守朋，曹珊，张仁宽，郑宇

（1.天津市利民调料有限公司，天津300308；2.天津科技大学生物工程学院，天津300457）

柿子是我国常见的果品，成熟的柿果色泽鲜艳、味甜多汁，具有较高的营养和药用价值。每100 g柿果可食部分约含蛋白质0.67 g、脂肪0.1 g、碳水化合物16 g～20 g、钙 10 mg、磷 19 mg 、铁 0.2 mg。此外还含有单宁酸、胡萝卜素、黄酮及瓜氨酸、无色花青素等功能物质[1]。中医认为柿子有清热、止咳、润肺、健脾、止痢、凉血、解酒毒等功效[2]。由于柿子的加工技术落后，目前市场上柿子的加工品种十分单调，除了带白霜的柿饼外，很少见到其它柿子加工品[3]。近年来随着人们生活水平的提高和生产技术的进步，以水果作为原料生产的果醋及果醋饮料由于其风味独特，且具有一定的保健功能受到市场的青睐，消费量逐年攀升[4]。开发新型果醋，是一个提高经济效益和社会效益非常有效的途径[5]，我国农产品的深加工。目前市场上所见的果醋品种单一，主要以苹果醋及其饮料为主，以柿子为原料发酵生产果醋，不仅可以充分开发利用柿子资源，还可以满足消费者对于饮料产品多样化的要求，具有显著的社会效益和经济效率。

百香果，香味浓郁、口感独特，素有“饮料之王”的美称。杨锋[6]等对百香果进行了加工适性的测定研究，研究表明百香果营养成分丰富，出汁率达43.33%，可溶性固形物16.5%，具有较好的热稳定性，是一种优质的果汁加工原料[7]。另外百香果还具有很高的营养价值和药用价值。它含有丰富的生物活性成分，主要包括多酚类，如芹菜素、荭草素、槲皮黄酮等，生物碱等[8-9]。它具有抗焦虑、镇静、抗炎等作用，此外，还具有降血糖、降血脂等生理功效[10-12]。

本论文以柿子为原料，发酵生产柿子醋，同时为了改善柿子果醋风味单一的缺点，以柿子原醋为基础，采用百香果汁进行调配，利用响应面法对柿子果醋、百香果、白砂糖的添加量进行优化，开发混合果汁果醋饮料产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

柿子：产自天津蓟县；百香果：产自云南省；中温型α-淀粉酶（2.0×103U/g）、纤维素酶（1.8×103U/g）、果胶酶（6.0×104U/g）、木瓜蛋白酶（2.0×103U/g）：天津滨海诺奥酶工程技术有限公司；亚硫酸：天津市大茂化学试剂厂；碳酸氢钠：天津市福晨化学试剂厂；柠檬酸：天津市北方天医化学试剂厂；硅藻土：天津市化学试剂三厂；果酒专用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋杆菌Acetobacter pasteurianus AC2005：中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC 3089。

1.2 主要设备

医用净化台：苏州净化设备厂；电热恒温培养箱：天津市实验仪器厂；电子分析天平：上海奥豪斯仪器有限公司；回旋式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；离心机：北京医用离心机厂；紫外分光光度计：苏州岛津仪器有限公司；恒温水浴振荡器：江苏荣华仪器；生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所。

1.3 柿子果醋饮料工艺流程

1.4 试验方法

1.4.1 柿子酒的制备

1.4.1.1 柿子酒的制备方法

将柿子果实进行分选清洗破碎，加入亚硫酸稀释液、纤维素酶、果胶酶，中温型α-淀粉酶稀释液搅拌混合均匀，置于50℃恒温水浴中酶解大约2 h后，酶解期间每0.5 h搅拌翻动一次。加入木瓜蛋白酶稀释液搅拌混合均匀继续置于55℃恒温水浴中酶解0.5 h，取出后迅速冷却到室温，得到柿子果浆；将柿子果浆经120目滤布过滤得到柿子果汁。分别向柿子果浆和柿子果汁中加入适量柠檬酸调整pH值至酵母菌生长最适pH为4.5，加入葡萄糖调整含糖量至200 g/L～220 g/L左右。将两组试验分别按照接种量2 g/kg（以活性干酵母粉质量计）接种酵母菌，在25℃条件下密闭发酵。待发酵液中还原糖含量基本稳定、气泡消失即视为发酵结束，终止发酵。将果浆组发酵液过12目滤布去除发酵后残留的果渣和酒脚。通过测定两组试验最终酒精度、糖度、多酚、氨基肽氮含量，确定最佳的酒精发酵原料。

1.4.1.2 柿子酒相关指标的检测方法

总糖的测定按照GB/T 5099.7-2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》。总酸的测定按照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》。总酚的测定参照牛雪[13]等人的方法。氨基酸态氮的测定按照GB/T 18186-2000《酿造酱油》。酒精度的测定按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.2 柿子醋制备

1.4.2.1 醋酸菌种子液制备

种子培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏15，自然pH值，121℃灭菌20 min，接种前加入无水乙醇至28 g/L。

刮取斜面试管中保存的菌体两环，接入到种子培养基中。30℃，培养27 h，至OD610为1.5，酸度1.2 g/100 mL以上。

1.4.2.2 柿子醋发酵条件优化

查阅文献得出发酵温度、接种量、初始乙醇浓度、初始酸度这4个条件为影响醋酸发酵的主要因素，并结合前期试验结果各选择3个水平对4个发酵条件进行优化。

最佳发酵温度的确定：设置发酵温度为28、30、32℃，在适宜条件下培养，检测发酵液中的产酸量，以确定最佳发酵温度。

最佳接种量的确定：利用得到的最佳发酵温度，设置接种量为5%、10%、15%，检测发酵液中的产酸量，以确定最佳接种量。

最佳初始乙醇浓度的确定：利用上述得到的最佳发酵条件，设置发酵初始乙醇浓度位7%、8%、9%，检测发酵液中的产酸量，以确定最佳初始乙醇浓度。

最佳初始酸度的确定：利用上述得到的最佳发酵条件，设置初始酸度为0.5%、1%、1.5%，检测发酵液中的产酸量，以确定最佳初始酸度。

上述4个单因素分别记作A、B、C、D进行四因素三水平正交试验，见表1。

表1 试验因素水平Table 1 Experimental factors and levels

1.4.2.3 柿子醋的澄清

柿子果醋中加入5%的明胶，恒温振荡培养箱170 r/min 振荡 1 h，进行澄清、除涩[14]。

1.4.3 柿子醋饮料调配

依据感官品评方法，结合单因素试验进行三因素三水平优化试验，确定柿子果醋、白砂糖、百香果汁调配比例。利用Design-Expert设计BOX-Behnken试验，以感官评分作为响应值，通过回归方程构建拟合因素与响应值的函数关系，寻求最优的变量组合，其因素编码水平如表2所示。

表2 Box-Behnken试验因素及水平Table 2 Box-Behnken experimental factors and levels

1.4.4 分析方法

邀请10名具有品评经验的人员，对不同调配下的百香柿子果醋饮料进行感官品评，评价指标分为色泽，香气，口感，体态4个方面总分10分，见表3。

2 结果与分析

2.1 柿子酒发酵原料的比较

柿子酒的品质直接决定柿子醋的品质，本论文比较了柿子果浆发酵酒和柿子果汁发酵酒的5种理化指标，如表4所示。

表3 感官评分标准Table 3 Criteria for sensory evaluation

表4 柿子果浆发酵酒和果汁发酵酒的比较Table 4 Comparison of persimmon wine with mash or must

利用果浆发酵制作柿子酒发酵结束后酒中总糖含量低于果汁发酵酒，同时果浆酒酒精度高于果汁酒，这可能由于柿子果皮和果肉中含有较多的营养物质促进了酵母的生长从而导致果浆酒酒精度较果汁酒高。另外果浆酒中的多酚含量明显高于果汁酒，提高了柿子酒的抗氧化能力，增强了产品的保健效果[15]，两种原料生产的总酸和氨基酸态氮含量相差不大。最终确定利用果浆发酵酒进行醋酸发酵。

2.2 柿子醋发酵工艺优化

2.2.1 温度对柿子醋发酵的影响

温度是影响微生物繁殖的重要因素之一，在一定温度范围内微生物的生长繁殖随着温度的上升而增加，过高的温度会在醋酸发酵中增加酸对菌体的伤害[16-17]。将柿子果浆酒置于不同的温度下进行醋酸发酵，温度设置为：28、30、32℃，见图 1。

如图1所示，在30℃条件下巴氏醋杆菌AC2005发酵产酸速率最快，该菌株最适的发酵温度为30℃。

2.2.2 接种量对柿子醋发酵的影响

接种量的大小直接影响发酵时间，增大接种量可以缩短发酵周期，但接种量过大时，菌体容易过早衰老，影响发酵效率[15]，见图 2。

图1 温度对柿子醋发酵的影响Fig.1 Effect of temperature on the persimmon vinegar fermentation

图2 接种量对柿子醋发酵的影响Fig.2 Effect of inoculation volume on persimmon vinegar fermentation

如图2所示，5%接种量相对于10%和15%接种量产酸量低，10%和15%接种量，最终产酸无明显区别，从节约成本方面考虑最终确定10%接种量为醋酸发酵最优接种量。

2.2.3 初始乙醇浓度对柿子醋发酵的影响

乙醇是醋酸菌发酵的底物，但过高的乙醇浓度对醋酸菌的生长有抑制作用[18]，见图3。

图3 初始乙醇浓度对柿子醋发酵的影响Fig.3 Effect of initial alcohol concentration on persimmon vinegar fermentation

如图3所示，8%的乙醇没有对醋酸菌产酸及生长有影响，且发酵效率高于7%初始乙醇浓度，而9%的乙醇则抑制了醋酸发酵，因此确定初始乙醇浓度为8%，摇瓶发酵产酸达（5.3±0.08）g/100 mL。

2.2.4 初始酸度对柿子醋发酵的影响

课题组前期研究表明，初始发酵条件下适宜的酸度会促进醋酸发酵的产酸速率和菌体的活性，过高的酸度会胁迫细胞质pH值的降低，导致一些相关的酸敏感糖分解酶的活性丧失（严重影响产生ATP的能力）和细胞膜、大分子物质（如DNA和蛋白质）的结构损坏[19]，见图 4。

图4 初始酸度对柿子醋发酵的影响Fig.4 Effect of initial acid concentration on persimmon vinegar fermentation

如图4所示，1%的初始乙酸会促进醋酸菌产酸及生长使发酵效率高于0.5%初始乙酸浓度，而1.5%的初始乙酸则会抑制醋酸菌菌体生长和发酵产酸效率。

2.2.5 正交试验

通过单因素试验得到的温度（A）、接种量（B）、初始乙醇浓度（C）、初始酸度（D）4个对产量影响较大的因素，以最佳数据左右相邻的数据作为各因素的3个水平进行正交试验设计L9（34），结果如表5所示。

表5 正交试验L9（34）Table 5 The orthogonal experiment

续表5正交试验L9（34）Continue table 5 The orthogonal experiment

由表 4 可以看出：RA＞RD＞RC＞RB，即对柿子醋发酵产酸的影响：温度＞初始酸度＞初始乙醇浓度＞接种量。同时由K值结果还可以得出最优发酵条件为A2B2C2D2，由于该组合并未在正交试验中出现，为了进一步验证结果，进行验证性试验，即按照组合A2B2C2D2进行柿子醋发酵试验，得到的最终酸度为5.94 g/100 mL，且酸度和得分为所有组合中最高。所以最优组合为A2B2C2D2；即：30℃、接种量10%、初始乙醇浓度8%、初始酸度1%。以此条件进行后续的试验。

2.3 响应面法优化百香柿子果醋饮料配方

2.3.1 柿子果醋添加量的确定

柿子果醋添加量对饮料风味的影响见图5。

图5 柿子果醋添加量对饮料风味的影响Fig.5 Effect of percentage of persimmon vinegar on beverage flavor

由图5可知，当柿子原醋添加量大于10%时，醋酸味较重，酸度偏高，直接饮用口感刺激明显，添加量过低则醋酸风味较低。果醋饮料中柿子醋的添加量在10%时，调配后的醋饮感官评分较高。

2.3.2 白砂糖添加量的确定

白砂糖添加量对饮料风味的影响见图6。

从图6可以看出白砂糖添加量在6%时感官评分较高，白砂糖添加量高于6%时，口感过于甜腻，掩盖了醋饮料的酸味特点；添加量低于6%时，醋味的刺激较明显，因此白砂糖添加量确定为6%。

2.3.3 百香果汁添加量的确定

百香果能够赋予柿子醋饮料独特的热带水果风味，且赋予了果醋金黄的色泽，不需要额外添加色素。百香果汁添加量少则果醋饮料的风味不足；添加量过多，则百香果风味过重，掩盖了醋的风味，见图7。

图6 白砂糖添加量对饮料风味的影响Fig.6 Effect of percentage of sugar on beverage flavor

由图7可知，柿子果醋饮料中的添加量在6%时调配后的饮料的感官评分最高。依据感官品评，结合单因素确定柿子原醋10%，白砂糖6%，百香果汁6%为较好调配比例，设计BOX-Behnken试验，以感官评分作为响应值，优化柿子原醋（A）、白砂糖（B）、百香果汁（C）添加量。Box-Behnken试验结果见表6，回归模型系数及显著性检验结果见表7，回归方程方差分析见表8。

表6 Box-Behnken试验结果Table 6 Results of Box-Behnken experimental

续表6 Box-Behnken试验结果Continue table 6 Results of Box-Behnken experimental

表7 回归模型系数及显著性检验结果Table 7 Regression coefficients and significance test for the constructed quadratic polynomial model equation

表8 回归方程方差分析表Table 8 Analysis of variance for the regression equation

对数据进行分析得到感官评分Y响应面的回归模拟方程：Y=9.20+0.28A+0.038B+0.76C-0.050AB+0.100AC-0.025BC-1.36A2-0.59B2-0.89C2。

由表7可知，模型项p＜0.000 1，说明Y与回归方程的关系极为显著，模型拟合较好，可信度极高。失拟差p=0.124 7＞0.05，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例较小，残差是随机产生，模型符合实际情况，可以用此模型对感官品评进行分析，结果可靠。由表8可知，模型的相关系数R2=0.9924，校正系数R=0.982 5。说明模型可以解释99.24%的感官品评，变异系数为1.85%，信噪比为28.630，试验的可靠性高。

为了进一步研究相关因素之间的交互作用，优化调配比例，本试验利用Design-Expert软件对回归模型进行响应面分析，得到相应的响应面立体图等高线图分析图，见图8。

图8 各因素交互作用对感官品评的响应曲面及等高线图Fig.8 Surface plots of combined effects of three factors on sensory

图8 等高线可以看出，A与B，B与C，A与C均有交互作用，但交互作用不明显。Y值随着A、B、C因素的增加先增加后减小，另外从响应面图可以看出，响应值Y存在最大值，及Y值越大，果醋饮料的口感越好，因而在优化标准上Y选取最大值。Design-Expert设计BOX-Behnken设计试验对数据进行分析，通Y值方程求解可得A、B、C对应的试验值为A=10.63，B=5.52，C=7.41，此条件下感官评分最高为9.3630。为了试验方便将结果修正为柿子原醋10.5%，白砂糖为5.5%，百香果汁为7.5%。在修正条件下3次平行试验，所得感官评分为9.02，与模型预测值相近，表明该结果能很好的预测实际情况。

3 结论

本试验以柿子果浆为底物发酵制酒，得到酒精度为12.5%的柿子酒。以柿子酒为原料采用单因素试验和正交试验优化柿子果醋发酵工艺，得出最优发酵条件为A2B2C2D2，即：30℃、接种量10%、初始乙醇浓度8%、初始酸度1%。经验证试验，最终酸度为5.94 g/100 mL。以此果醋为主要原料，辅以百香果汁及白砂糖，研制新型果醋饮料。经响应面优化后柿子果醋饮料配方为：柿子果醋10.5%，白砂糖5.5%，百香果汁7.5%。最终饮料产品总酸度为（0.53±0.08）g/100 mL，总糖为 6.95%。其香味独特，口感酸甜，清朗爽口，适合大众饮用。

参考文献：

[1]蒲飞.柿果实酚类物质含量、生物活性及其相关酶的研究[D].西安：西北农林科技大学,2014

[2]胡婉珊,郭琳博,李宇华,等.柿子加工中关键技术的研究进展[J].食品科学,2010,31(13)：342-346

[3]白卫东,刘晓艳,赵文红,等.柿子醋饮料的加工工艺研究[J].食品与机械,2007,23(5)：247-249

[4]张荣展,张仁宽,苏广玉,等.巴氏醋杆菌AC2005苹果醋发酵工艺优化[J].饮料工业,2015(5)：42-46

[5]吴国卿,王文平,陈燕.果醋开发意义、工艺研究及果醋类型[J].饮料工业,2010,13(4)：14-17

[6]杨锋,黄永春,何仁,等.百香果加工适性的测定及提高其出汁率的研究[J].食品研究与开发,2008,29(5)：82-85

[7]霍丹群,蒋兰,马璐璐,等.百香果功能研究及其开发进展[J].食品工业科技,2012,33(19)：391-395

[8]Zeraik M L,Yariwake J H.Quantification of isoorientin and total flavonoids in Passiflora edulis fruit pulp by HPLC-UV/DAD[J].Microchemical Journal,2010,96(6)：86-91

[9]Antognoni F,Zheng S,Pagnucco C,et al.Induction of flavonoid production by UV-B radiation in Passiflora quadrangularis callus cultures[J].Fitoterapia,2007,78(5)：345-352

[10]Gupta R K,Kumar D,Kumar A,et al.Antidiabetic activity of Passiflora incarnata Linn.in streptozotocin-induced diabetes in mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2012,139(3)：801-806

[11]Ana C S,Andrade A,Brito S,et al.Effects of compounds from Passiflora edulis Sims f.flavicarpa juice on blood coagulation and on proteolytic enzymes[J].Protein and Peptide Letters,2012,19(5)：501-508

[12]De S M S,Barbalho S M,Damasceno D C,et al.Effects of Passiflora edulis(Yellow Passion)on serum lipids and oxidative stress status of Wistar rat[J].Journal of Medicinal Food,2012,15(1)：78-82

[13]牛雪.福林酚法测定葡萄酒总酚的优化研究[D].银川：宁夏大学,2015

[14]陈珍金,郭伟灵,贾瑞博,等.柿子醋液态发酵工艺优化及澄清剂对柿子醋品质的影响[J].中国酿造,2017,36(7)：63-66

[15]Alonso A M,Castro R,Rodriguez M C,et al.Study of the antioxidant power of brandies and vinegars derived from Sherry wines and correlation with their content in polyphenols[J].Food Research International,2004,37(7)：715-721

[16]刘月梅,白卫东,鲁周民,等.柿子原浆果醋加工工艺研究[D].西安：西北农林科技大学,2008

[17]Fregapane G,Rubiofernandez H,Desamparados S M.Influence of fermentation temperature on semi-continuous acetification for wine vinegar production[J].European Food Research&Technology,2001,213(1)：62-66

[18]Ide O,Romero L E,Cantero D.Optimum starting-up protocol of a pilot plant scale acetifier for vinegar production[J].Journal of Food Engineering,2002,52(1)：31-37

[19]Zheng Y,Zhang R,Yin H,et al.Acetobacter pasteurianus metabolic change induced by initial acetic acid to adapt to acetic acid fermentation conditions[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2017,101(18)：7007-7016