α-突触核蛋白对小鼠星形胶质细胞的激活作用*

王进堂 ，Jeremy Walston，Peisong Gao，高茂龙 ，Sean X Leng，陈峥

（1.北京老年医院 老年病临床与康复研究所，北京 100095；2. Division of Geriatric Medicine and Gerontology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine，Baltimore 21224, USA; 3. Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore 21224, USA）

α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）正常存在于突触前神经终端，产生生理功能[1]。其异常代谢或产物被释放到细胞外基质，激活胶质细胞和固有免疫反应，引起神经元损伤[2-4]，成为某些神经退行性疾病的发病机制之一[5-6]。有证据表明，α-syn突变和聚合可以激活小胶质细胞产生炎症反应[4，7]，但其对星形胶质细胞的激活作用，目前仍有争议。本研究利用α-syn及其A53T突变型检测α-syn对Toll样受体（toll-like receptors, TLRs） 1～4和核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB, NF-κB）表达的影响，以证实其是否参与星形胶质细胞介导的免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM/F12细胞培养剂和胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自美国Gibco公司，野生型和A53T α-syn购自美国rPeptide公司，β-Actin初级抗体﹑Alexa Fluor®514羊抗兔二级抗体﹑实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）试剂盒﹑DAPI核染色剂购自美国Thermo Fisher公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记二级抗体（美国Cell Signaling公司），TLR-2﹑胶质纤维原酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）﹑NF-κB初级抗体购自美国Abcam公司。

1.2 细胞分离和培养

混合胶质细胞分离于新生（3～4 d）C57BL/6小鼠的大脑皮层，根据细胞黏附程度，将星形胶质细胞与其他细胞，如小胶质和少突胶质细胞分离[8]。取出大脑皮层，经胰蛋白酶消化制成细胞悬浮液，在聚赖氨酸包被的培养瓶及37℃﹑5%二氧化碳CO2﹑95%湿度培养箱中用DMEM/F12（含10% FBS﹑100u/ml青霉素﹑100μg/ml链霉素）培育16 h，通过剧烈摇动和清洗，继续培养3～5 d，然后根据需要分离于多个培养瓶，培养至90%覆盖时即可使用。

1.3 荧光显微镜观察

在盖玻片上培养星形胶质细胞，用冰冷的甲醇和丙酮（1∶1）溶液固定5min，予以生理盐水PBS（pH 7.4）冲洗10～15min，2.25%甘氨酸室温下作用20min，PBS反复冲洗后包被缓冲液（1%牛血清白蛋白﹑0.3% Triton X-100﹑10%山羊血清）室温下作用1 h，PBS反复冲洗后用GFAP初级抗体（兔抗鼠1∶1 000）4℃过夜，PBS反复冲洗后用Alexa Fluor®514二级抗体（羊抗兔，1∶1 000）室温下作用1 h，PBS反复冲洗后用1μg/ml DAPI进行细胞核荧光染色10min。封片后在荧光显微镜（日本尼康公司，型号ECLIPSE Ni-U）下检查。

1.4 细胞药物处理

将传代的星形胶质细胞在6孔板上分成多个处理组，替换新鲜培养液，分别加入适当浓度的药物[7]：2和20μg/ml野生型α-syn﹑A53T突变型，留取0%药物作为对照，继续常规培养24 h。然后按分组进行细胞裂解液（0.5 ml/孔Trizol液）的RNA提取和蛋白裂解液（0.2 ml/孔）的蛋白质提取，分别用于qRT-PCR和Western blot检测。

1.5 qRT-PCR

qRT-PCR测定TLRs 1～4和NF-κB mRNA的表达水平，并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的表达作为内部参照。在分光光度计（型号NanoDrop™ 2000）上严格按照美国Applied Biosystems公司提供的TaqMan基因表达分析程序进行测定。目标转录物用美国TaqMan公司探针测定：TLR1（Mm01208874_m1），TLR2（Mm00442346_m1），TLR3（Mm00628112_m1），TLR4（Mm00445273_m1），NF-κB（Mm00476361_m1），其相对丰度用GAPDH（Mm03302249_g1）进行标准化处理。基因表达改变=ΔCt值-GAPDH参照值，然后计算ΔΔCt和倍数差异数，用于统计学处理。

1.6 Western blot检测

用Western blot检测TLR2和NF-κB蛋白的表达，以β-actin作为内部对照。用Bradford试剂（美国Bio-Rad公司）测定蛋白浓度，取30μg蛋白质加热至95℃变性，经Bio-Rad电泳仪电泳和聚偏二氟乙烯膜半干转移仪转膜，进行初级抗体（4℃过夜）和HRP结合二级抗体（室温1 h）孵育。然后分别用增强化学荧光试剂盒（美国Bio-Rad公司）在暗室显影。

1.7 统计学方法

数据分析采用SAS 9.1.3统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 星形胶质细胞荧光显微镜观察

本研究提取的星形胶质细胞清除了绝大多数其他细胞类型。免疫荧光分析显示，不同形态的GFAP阳性细胞代表星形胶质细胞数，DAPI阳性细胞代表细胞总数。在镜下随机选取5个视野进行细胞计数，GFAP阳性细胞占（93.96±4.03）%。见图1。

图1 星形胶质细胞免疫荧光分析

2.2 α-Syn诱导TLRs的表达

TLRs是固有免疫反应中用于识别各种内源性或外源性抗原的一组受体。经A53T突变型刺激24 h后，2和20μg/ml A53T突变型组与对照组的TLRs 1～4 mRNA表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=4.490﹑7.617﹑7.328和4.031，P=0.027﹑0.005﹑0.009和 0.048）。进一步两两比较经LSD-t检验，2和20μg/ml A53T突变型组TLRs 1～4 mRNA表达水平高于对照组，其中以TLR1 mRNA和TLR2 mRNA增长幅度较大（见图2）。Western blot检测结果显示，当A53T突变型浓度增加到20μg/ml，TLR2蛋白的表达水平升高（见图3）。结果提示，α-syn诱导和激活星形胶质细胞介导的固有免疫反应。另外，野生型α-syn对TLRs也产生较弱的免疫诱导效应。

2.3 α-Syn诱导NF-κB的表达

NF-κB作为非常重要的转录因子，是多种炎症因子基因表达的上游调节分子，在固有免疫炎症通路中发挥中枢和核心的调控作用。分别经野生型α-syn﹑A53T突变型处理后，2和20μg/ml A53T突变型组与对照组的NF-κB mRNA表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=4.640和9.810，P=0.047和0.008）。进一步两两比较经LSD-t检验，2和20μg/ml A53T突变型组NF-κB mRNA表达水平高于对照组。其中，经野生型α-syn处理后，20μg/ml A53T突变型组较2μg/ml A53T突变型组NF-κB mRNA表达水平升高幅度较大（P＜0.05）（见图4）。Western blot检测结果显示，当A53T突变型浓度增加到20μg/ml，NF-κB蛋白的表达水平升高（见图5）。结果提示α-syn能提高NF-κB表达的水平，增加固有免疫反应程度，并且A53T突变型具有较强的刺激活性。

图2 A53T突变型对TLRs 1～4表达的激活作用 （±s）

图3 TLR2蛋白的表达

图4 野生型α-syn及A53T突变型对NF-κB表达的激活作用 （±s）

图5 NF-κB蛋白的表达

3 讨论

大量研究证明，在神经退行性疾病的发病机制中，星形胶质细胞扮演重要角色，其激活固有免疫和炎症反应，促进神经元毒性微环境的形成[2-3，5]。近年来，在α-syn介导的神经元变性的炎症病理中，研究的重点都放在α-syn对小胶质细胞的致炎效应上[7，9]，包括TLRs表达和促炎症细胞因子分泌等，然而其对星形胶质细胞的免疫诱导作用却很少得到关注。本实验证实，α-syn及其A53T突变型上调TLRs 1～4和NF-κB的表达水平，且A53T突变型具有较强的诱导效应，揭示α-syn能刺激星形胶质细胞，激活脑的固有免疫反应。

关于α-syn对星形胶质细胞的激活效应，仅有几篇文献报道，例如将神经元分泌的α-syn直接作用于星形胶质细胞，诱导炎症反应，刺激IL-6﹑IL-1β﹑ICAM-1 的释放和 CXCL10 的表达[8，10-11]。TLRs作为免疫原识别受体也参与神经变性的炎症病理变化，并且与α-syn诱导的免疫反应密切相关，例如在小胶质细胞，α-syn上调TLR2﹑TLR3和TLR7的表达，并且激活炎症反应[7，12]，而对NF-κB和TNF-α没有作用[12]。然而在星形胶质细胞中，α-syn诱导的TLRs激活罕有报道，目前仍不清楚。本研究结果弥补这一事实，证实TLRs 1～4都得到激活。NF-κB作为神经炎症通路的关键转录因子，直接参与神经炎症和神经变性病理变化，这已在小胶质细胞得到证实[13]，同时α-syn也上调小胶质细胞NF-κB的表达[14]。本研究证实，α-syn提高星形胶质细胞NF-κB表达，与其对TLRs的诱导效应是一致的，进一步提示α-syn通过刺激星形胶质细胞，激活脑的固有免疫反应，为神经退行性疾病的致病机制的研究提供了有力的免疫学证据。

综上所述，α-syn作为神经细胞的异常代谢产物，是一种较强的免疫原物质，增加星形胶质细胞的TLRs活性，提高NF-κB的表达，直接参与对脑固有免疫的激活，并且A53T突变型具有较强的免疫诱导效应，为α-syn参与星形胶质细胞介导的神经退行性疾病的病理机制研究提供了有力的免疫学证据。

致谢 感谢美国约翰霍普金斯大学医学院Sean Leng教授实验室提供实验条件。

参 考 文 献：

[1]NORRIS E H, GIASSON B I, LEE V M. Alpha-synuclein: normal function and role in neurodegenerative diseases[J]. Curr Top Dev Biol, 2004, 60: 17-54.

[2]MA D, JIN S, LI E, et al. The neurotoxic effect of astrocytes activated with toll-like receptor ligands[J]. J Neuroimmunol, 2013,254(1/2): 10-18.

[3]LEE H J, SUK J E, PATRICK C, et al. Direct transfer of alphasynuclein from neuron to astroglia causes inf l ammatory responses in synucleinopathies[J]. J Biol Chem, 2010, 285: 9262-9272.

[4]MORI F, TANJI K, YOSHIMOTO M, et al. Demonstration of alpha-synuclein immunoreactivity in neuronal and glial cytoplasm in normal human brain tissue using proteinase K and formic acid pretreatment[J]. Exp Neurol, 2002, 176: 98-104.

[5]GOEDERT M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases[J].Nat Rev Neurosci, 2001, 2: 492-501.

[6]LAWAND N B, SAADÉ N E, EL-AGNAF O M, et al. Targeting α-synuclein as a therapeutic strategy for Parkinson’s disease[J].Expert Opin Ther Targets, 2015, 19: 1351-1360.

[7]ROODVELDT C, LABRADOR-GARRIDO A, GONZALEZREY E, et al. Preconditioning of microglia by α-synuclein strongly affects the response induced by toll-like receptor (TLR)stimulation[J]. PLoS One, 2013, 8: e79160.

[8]GORINA R, FONT-NIEVES M, MÁRQUEZ-KISINOUSKY L, et al. Astrocyte TLR4 activation induces a proinflammatory environment through the interplay between MyD88-dependent NF-κB signaling, MAPK, and Jak1/Stat1 pathways[J]. Glia, 2011, 59:242-255.

[9]KIM C, HO D H, SUK J E, et al. Neuron-released oligomeric α-synuclein is an endogenous agonist of TLR2 for paracrine activation of microglia[J]. Nat Commun, 2013, 4: 1562.

[10]KLEGERIS A, GIASSON B I, ZHANG H, et al. Alpha-synuclein and its disease-causing mutants induce ICAM-1 and IL-6 in human astrocytes and astrocytoma cells[J]. FASEB J, 2006, 20:2000-2008.

[11]LEE H J, KIM C, LEE S J. Alpha-synuclein stimulation of astrocytes: potential role for neuroinflammation and neuroprotection[J]. Oxid Med Cell Longev, 2010, 3: 283-287.

[12]BÉRAUD D, TWOMEY M, BLOOM B, et al. α-Synuclein alters toll-like receptor expression[J]. Front Neurosci, 2011, 5: 80.

[13]LANZILLOTTA A, PORRINI V, BELLUCCI A, et al. NF-κB in innate neuroprotection and age-related neurodegenerative diseases[J]. Front Neurol, 2015, 6: 98.

[14]REYNOLDS A D, GLANZER J G, KADIU I, et al. Nitrated alpha-synuclein-activated microglial profiling for Parkinson’s disease[J]. J Neurochem, 2008, 104: 1504-1525.