MicroRNA-153对脑膜瘤细胞放疗敏感性的影响*

刘义锋，张保朝，温昌明，闻公灵，周国平，张敬伟，贺海发，汪宁，李巍

（1.郑州大学附属南阳中心医院 神经内科，河南 南阳 473003；2.郑州大学附属南阳中心医院 神经外科，河南 南阳 473003；3.郑州大学附属南阳中心医院 肿瘤内科，河南南阳 473003；4.郑州大学附属南阳中心医院 病理科，河南 南阳 473003；5.沈阳军区总医院 神经内科，辽宁 沈阳 110016）

脑膜瘤是常见的颅内肿瘤之一，其发病率占颅内肿瘤的13%～26%，仅次于神经胶质瘤[1]。部分早期文献报道，放射治疗对脑膜瘤的敏感性较低[2]。但是放射治疗已成为一种重要的治疗脑膜瘤的方法。

目前，microRNA（miRNA）在脑膜瘤中的研究较少，可能与其为良性肿瘤有关。有研究报道，miR-200a可以通过调控E-cadherin和Wnt/β-catenin信号通路，促进脑膜瘤肿瘤细胞的生长[3]。本文主要研究miR-153在脑膜瘤细胞放疗敏感性中的作用及其机制，为研究脑膜瘤的放射治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人类恶性脑膜瘤细胞系SF3061为本实验室保存细胞株，DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），miR-153mimics﹑miR-control购自广州锐博生物科技有限公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega公司），视网膜母细胞瘤蛋白结合锌指1（retinoblastoma protein-interacting zinc finger 1, RIZ1）抗体﹑β-actin抗体及酶标二抗购自美国Cell Signaling Technology公司，si-RIZ1及sicontrol﹑Lipofectamine 2000转染试剂盒﹑逆转录试剂盒﹑SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自美国Introvigen公司，医用直线加速器（德国Siemens公司），流式细胞仪（美国BD公司），其他常用试剂购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将液氮中冻存的SF3061细胞复苏，在5%二氧化碳CO2﹑37℃及饱和湿度条件下的DMEM培养液（含10%胎牛血清﹑2μmol/L L-谷氨酰胺﹑50 IU/ml青霉素）中培养。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期的细胞，以2×105个/孔的密度接种于6孔板，所用培养液不含抗生素，在5% CO2﹑37℃恒温细胞培养箱中进行培养。待细胞融合达70%～80%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，分别将miR-153mimics﹑miR-control﹑si-RIZ1及si-control转染到细胞中。转染48 h后，收集细胞用于后续实验。

1.2.3 细胞辐射 在细胞转染或药物处理48后，使用直线加速器6 MeV-X射线垂直照射细胞，实验过程中使用射线防护铅屏风保护工作人员避免辐射损伤，辐射剂量分别为0﹑2﹑4﹑6和8 Gy，检测凋亡的细胞辐射量为4 Gy，照射后细胞继续培养48 h，用于后续实验。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 将照射处理后的细胞常规培养，当融合率达70%～80%时，收集细胞，用miRNA抽提试剂盒提取细胞中的miRNA。用逆转录试剂盒将miRNA转化成cDNA，加入SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，以U6为内参进行qRT-PCR扩增，miRNA的相对表达量用2-△△Ct分析。

1.2.5 Western blot检测 将照射处理后的细胞消化并离心收集，加入RIPA使细胞裂解，超声破碎后离心收集蛋白，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度。每个样本取50μg进行8%或12% SDS-PAGE电泳，将分离后的蛋白进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h后，加入RIZ1一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育1 h。ECL显影检测蛋白表达。

1.2.6 MTT法 将照射处理后的细胞进行消化，以2×105个/孔的密度接种于96孔板中，37℃﹑5%CO2﹑完全湿度条件下培养48 h，加入10μl MTT溶液，孵育4 h后，弃掉培养液，加入150μl/孔MTT溶液，震荡摇匀后，酶标仪检测490 nm处的光密度（optical density, OD）值，细胞的增殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.2.7 流式细胞仪 将待测细胞使用4 Gy的放射线剂量进行照射，照射后48 h收集细胞，放射处理后将细胞消化计数并接种到6孔板中，PBS清洗3次，使用500μl Binding buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×105个/孔，各孔加入5 μl Annexin V-FITC和5μl PI混匀，室温避光孵育15min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.8 克隆形成实验 分别以0﹑2﹑4﹑6﹑8和10 Gy剂量照射细胞后，将各组单细胞悬液接种到6孔板中，于37℃﹑5%CO2培养箱中继续培养10～14 d。PBS清洗3次，甲醇固定后，用吉姆萨染色，于显微镜下进行集落计数（＜50个细胞的集落为有效集落），计算克隆形成率，并根据单击多靶模型拟合细胞存活曲线。

1.2.9 双荧光素酶报告实验 将含有miR-153结合位点的PRDM2 3’-UTR序列及其突变体插入pMIRREPORT载体荧光素酶报告基因下游，分别得到含野生型RIZ1 3’-UTR的载体，命名为WT-3’-UTR；含突变型RIZ1 3’-UTR的载体，命名为MUT-3’-UTR。将构建好的质粒分别与miR-153 mimics﹑miR-control共转染SF3061细胞，继续培养48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗对脑膜瘤细胞内miR-153表达的影响

本实验以4 Gy的放射量对脑膜瘤细胞进行放疗，利用qRT-PCR检测放疗前后细胞内miR-153表达水平的变化。mRNA定量检测结果表明，与对照组相比，放疗组miR-153相对表达水平为（0.45±0.05），经t检验，差异有统计学意义（t=8.590，P=0.007），放疗组miR-153的表达水平低于对照组。见图1。

2.2 高表达miR-153对脑膜瘤细胞放疗敏感性的影响

本实验将miR-153mimics及其对照miR-control转染到脑膜瘤细胞中，观察高表达miR-153在脑膜瘤细胞放疗敏感性中的作用。对照组﹑miR-control组﹑miR-153mimics组在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射剂量下细胞的增殖抑制率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=35.325﹑91.020﹑85.868﹑136.220和73.608，P=0.001﹑0.000﹑0.000﹑0.000和 0.000），放疗后高表达miR-153可以增加脑膜瘤细胞的增殖抑制率。见表1和图2。

流式细胞仪检测结果表明，放疗后对照组﹑miR-control组﹑miR-153mimics组脑膜瘤细胞的凋亡率 分 别 为（16.79±2.16）%﹑（19.85±2.36）% 和（35.75±4.45）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=5.956，P=0.0.006），高表达miR-153脑膜瘤细胞的凋亡率高于对照组和miR-control组。见表1和图3。

图1 放疗前后脑膜瘤细胞中miR-153的表达水平比较（±s）

表1 高表达miR-153克隆形成实验单击多靶模型的参数

图2 高表达miR-153对脑膜瘤细胞增殖的影响

对照组与miR-153mimics组在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射剂量下的细胞克隆形成率比较，经t检验，差异有统计学意义（t=8.004﹑12.713﹑ 12.068﹑14.751和10.063，均P=0.000），高表达miR-153细胞放疗后克隆形成率较对照组降低。对克隆形成实验数据进行曲线拟合，发现高表达miR-153细胞具有较高的放疗增敏性。见表1和图4。

2.3 miR-153靶向RIZ1

本实验利用TargetScan预测miR-153的靶基因，结果发现RIZ1的基因PRDM2 3’-UTR与miR-153可能有相互作用。见图5。

Western blot检测结果表明，miR-control组﹑miR-153mimics组RIZ1蛋白相对表达量分别为（2.71± 0.23）和（0.41±0.03），经t检验，差异有统计学意义（t=17.175，P=0.000），在高表达miR-153细胞中，RIZ1的表达降低。见图6。

双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染miR-153mimics的RIZ1野生型﹑RIZ1突变型细胞相对荧光素酶活性分别为（0.43±0.05）和（1.12±0.09），经t检验，差异有统计学意义（t=11.608，P=0.000），共转染RIZ1野生型细胞的荧光素酶活性低于共转染RIZ1突变型细胞，证实RIZ1为miR-153的靶标，其在脑膜瘤放疗敏感性中发挥重要作用。见图7。

2.4 基因敲除RIZ1对脑膜瘤细胞放疗敏感性的影响

通过TargetScan预测及双荧光素酶报告基因证实miR-153能够直接靶向RIZ1。本实验进一步探索miR-153是否通过靶向RIZ1而增加脑膜瘤细胞的放疗敏感性。首先利用基因敲除技术将RIZ1基因沉默，再检测RIZ1沉默后细胞的增殖﹑凋亡及克隆形成情况。对照组﹑si-control组﹑si-RIZ1组在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射剂量下细胞的增殖抑制率比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=156.500﹑60.875 ﹑78.868 ﹑ 82.581和 52.625，均P=0.000），表明 RIZ1沉默后细胞的放疗敏感性增加，细胞的生长抑制率升高。见表2和图8。

si-control组与si-RIZ1组在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射剂量下的细胞克隆形成率比较，经t检验，差异有统计学意义（t=16.455﹑9.959﹑11.356﹑11.590和9.093，均P=0.000），表明RIZ1沉默后细胞的克隆形成数减少。见表2和图9。

凋亡实验结果显示，对照组﹑si-control组﹑si-RIZ1组脑膜瘤细胞的凋亡率分别为（15.6±1.68）%﹑（17.6±2.13）%和（36.8±4.12）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=6.363，P=0.007），si-RIZ1组脑膜瘤细胞的凋亡率高于对照组和si-control组。对细胞克隆形成数据进行存活曲线拟合，结果显示RIZ1沉默后放疗敏感性增加，表明miR-153可以通过靶向RIZ1，增加脑膜瘤细胞放射敏感性。见表2和图10。

图4 细胞的克隆形成率

图5 miR-153与RIZ1的结合位点

图6 转染miR-153后RIZ1蛋白的表达

图7 双荧光素酶活性比较 （±s）

表2 基因敲除RIZ1克隆形成实验单击多靶模型的参数

图8 敲除RIZ1对脑膜瘤细胞增殖的影响

图9 两组细胞克隆形成率比较

图10 基因敲除RIZ1对脑膜瘤细胞凋亡的影响 （±s）

3 讨论

脑膜瘤是常见的颅内肿瘤之一，其首选的治疗方法是手术切除，术后的辅助治疗取决于肿瘤的切除程度和脑膜瘤的病例类型。脑膜瘤的术后辅助放疗可以用于良性脑膜瘤次全切除术后﹑恶性脑膜瘤的术后放疗及不典型增生型脑膜瘤切除术后[4]。另外，部分患者有手术禁忌证，手术实施困难或存在术后高风险，可以首选放疗。因此，了解脑膜瘤的放疗机制有助于其在脑膜瘤临床中的应用。

miRNA广泛存在于真核生物中，是一类由19～25个核苷酸组成的内源性非编码单链RNA，可以通过与靶基因相互作用而降解靶mRNA或抑制靶基因的翻译，还可以调控靶基因的转录和翻译而对靶基因进行转录后调控[5]。miRNA与肿瘤的发生﹑发展及抗肿瘤的放化疗敏感性密切相关。陈华林等[6]报道，miR-125a高表达后可以增加肺癌A549细胞的放疗敏感性，增加放疗后细胞的凋亡率。将miR-18a模拟物转染到A549肺癌细胞中，检测不同剂量照射后细胞的克隆形成能力及存活能力，结果发现高表达miR-18a可以增强肺癌A549细胞的放疗敏感性，miR-18a可能是通过下调共济失调-毛细血管扩张症突变基因的表达，介导细胞的放疗敏感性[7]。

在本研究中，经过4 Gy剂量的放疗，细胞中miR-153的表达降低，笔者推测miR-153可能与脑膜瘤的放疗敏感性相关。本实验进一步使用脂质体转染技术将miR-153模拟物转入脑膜瘤细胞中，观察高表达miRNA-153对脑膜瘤细胞放疗敏感性的影响，结果表明经过放疗，高表达miR-153可以提高脑膜瘤细胞的增殖抑制率和凋亡率，抑制细胞的克隆形成率，证实miR-153可以在脑膜瘤中增加放疗敏感性。miR-153的异常表达与多种肿瘤的发生﹑发展相关，如前列腺癌中，高表达miR-153可以促进细胞周期转换，促进细胞增殖，而抑制miR-153的表达起到相反的作用[8]。在上皮癌中，下调miR-153可以促进细胞的上皮间质转化及转移[9]。miR-153在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因的作用，其可以通过靶向整合素和金属蛋白酶19，抑制癌细胞的侵袭和迁移[10]。KIM等[11]在少突神经胶质瘤中筛选了与放疗敏感性相关的miRNA，共65个，miR-153在少突神经胶质瘤患者术后放疗中表达上调。大量文献证明，miR-153与肿瘤细胞放疗敏感性关系密切。

RIZ是新发现的一种肿瘤抑制基因，是用Rb探针对可与Rb结合的蛋白质进行功能性筛选时分离出来的[12]。该基因在人类染色体的位置为1p36。RIZ1基因基于转录位点的不同可表达2种蛋白：RIZ1和RIZ2。RIZ1蛋白属于壳蛋白甲基转移酶超家族，该家族成员在人体生长发育及肿瘤形成过程中发着重要作用[13]。RIZ1可以通过其PR-domain，介导蛋白质-蛋白质相互作用及锌指结构来调控染色质的表达[14]。

随着对RIZ研究的不断深入，发现其与多种肿瘤的发生﹑发展密切相关。有研究发现，80%肝癌细胞中未检测到RIZ1的转录，而在肝癌组织中RIZ1也呈低表达，高表达的RIZ1在肝癌细胞系中可以导致细胞周期阻滞并促进细胞凋亡[15]。在乳腺癌的研究中同样发现，RIZ1在乳腺癌组织或细胞系中表达降低，高表达RIZ1可以阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡[16]。在卵巢癌中，卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中RIZ1基因和蛋白表达均低于正常的卵巢组织[17]。RIZ1的表达还能够诱导AML193和K562髓性白血病细胞株的凋亡[18]。在脑膜瘤中，高表达的RIZ1可以抑制细胞增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡[19]。本研究首先通过TargetScan预测RIZ1可能是miR-153的靶基因，RIZ1的基因PRDM2 3’-UTR可能与miR-153有相互作用，进一步的双荧光素酶报告基因实验证实RIZ1为miR-153的靶标。本实验又用基因敲除技术将RIZ1基因沉默，发现RIZ1沉默后能够增加脑膜瘤细胞的放疗敏感性，结果提示RIZ1可能与肿瘤细胞的放疗敏感性有关。

本实验证明，miR-153通过靶向干扰RIZ1，增加脑膜瘤细胞的放疗敏感性。这对防止脑膜瘤术后复发及增加脑膜瘤的放疗效果具有重要意义，也为治疗脑膜瘤提供了新的靶标。

参 考 文 献：

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