无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

杜吉革，薛麒，朱真，李启红，印春生，姚文生，康凯，陈小云

（中国兽医药品监察所牛羊病实验室，北京 100081）

0 引言

【研究意义】 产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原，严重危害着畜牧业的健康发展[1-4]。该菌的主要致病因子是其分泌的能引起人和动物发病的外毒素[5]。其中，ETX是该菌所有外毒素中毒力最强的毒素[6]，可引起动物的坏死性肠炎或者肠毒血症[7-9]，导致感染动物在很短的时间内死亡[10-11]，从而使抗生素治疗失去意义，疫苗注射成为了防治该病的主要手段。然而，传统ETX的类毒素疫苗抗原成分复杂，有效抗原量较低，且脱毒过程中存在一定的安全隐患。因此，实现ETX的减毒乃至无毒，对于开发ETX基因工程亚单位疫苗具有重要意义。【前人研究进展】ETX是由B型和D型产气荚膜梭菌产生[12]，由296个氨基酸构成。ETX以毒素前体的形式分泌于菌体外[13]，随后毒素前体在宿主的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身蛋白酶的作用下去掉N端11—13个以及C端22—29个氨基酸，从而成为活化的成熟毒素[14-15]。该毒素属于成孔毒素家族，在结构上主要分为I、II和III 3个区域，分别在毒素与细胞受体结合过程、与细胞受体结合稳定性的维持以及细胞膜穿孔的形成过程中发挥着重要作用[16]。由于该毒素有 2条肽链同时跨过 I，II和III 3个区域[17]，导致仅使用毒素的一个域作为疫苗候选抗原的策略（如 α、β毒素的 C末端[18-19]）很难应用于该毒素的防控。已有的研究证实，组氨酸残基是影响 ETX蛋白活性的关键性氨基酸，而第106位的组氨酸突变为脯氨酸的重组ETX基本是无毒的[20-22]。此外，ETX中I区域内的一组芳香族氨基酸（Tyr29、Tyr30、Tyr36、Tyr196以及Phe199）构成了毒素的受体结合区域[23]。其中，第199位的苯丙氨酸突变为谷氨酸后，突变体的细胞毒性明显下降（约为野生型重组毒素的1/2 527）。进一步的研究发现，以上两种单位点突变体的蛋白质三级结构并未发生明显改变，说明以上两处氨基酸位点发生突变后，蛋白活性的改变与结构并没有直接的关系，从而保持了良好的抗原性[24]。【本研究切入点】前人的研究主要是在野生型 ETX基础上进行单点突变，表达的重组蛋白可溶性较低，不利于后续的大量生产和纯化。已有的研究发现，将目的基因按照大肠杆菌偏好的密码子进行优化后可明显提高目的蛋白的可溶表达[25-27]。此外，单个氨基酸突变的ETX在未来基因工程疫苗大规模生产中存在一定的生物安全隐患。【拟解决的关键问题】本研究根据现行D型产气荚膜梭菌制苗用菌株（C60-2株）ETX的编码序列，按大肠杆菌偏爱的密码子进行优化设计和人工合成，并将其第106和第199位氨基酸位点同时进行突变，经原核系统表达、纯化和鉴定，并对重组蛋白的毒力和免疫保护性进行研究，为 D型产气荚膜梭菌的防制提供一定的数据支持。

1 材料与方法

试验于2017年4—10月在中国兽医药品监察所牛羊病实验室完成。

1.1 试验材料

D型产气荚膜梭菌C60-2株、D型产气荚膜梭菌C60-2株天然毒素、D型产气荚膜梭菌抗血清以及pET-30a(+)表达载体为中国兽医药品监察所牛羊病实验室保存；1.5—2.0 kg普通级健康日本大耳兔和16—18g ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受态细胞Top10和BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司；Montanide ISA 201佐剂购自法国赛彼科（seppic）公司；Ni-IDA亲和层析介质试剂盒、蛋白 Marker、Western blot Marker、 蛋 白 溶 解 液 （ 50 mmol·L-1Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol·L-1NaCl, pH 8.0），均购自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶（KFX-401S）购自东洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker购自Takara公司。T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自Promaga公司；限制性内切酶NdeⅠ和HindIII购自NEB公司；抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司；明胶缓冲溶液，LB培养基购自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密码子优化

以前期扩增获得的 D型产气荚膜梭菌 C60-2株 ETX编码基因为模版，按大肠杆菌偏爱的密码子进行优化设计，并将第106位组氨酸以及第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸。此外，在目的基因3′端添加6*His标签蛋白编码序列，最后由南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因GETXm2。

1.3 ETX突变体原核表达载体的构建

以GETXm2基因为模板，采用引物对GETXm2-F/GETXm2-R进行PCR扩增。其中上游引物GETXm2-F序列为：5′-CGCCATATG AAAGAAATCTC -3′，其5′端引入限制性内切酶NdeⅠ位点（下划线部分）及保护性碱基；下游引物 GETXm2-R序列为：5′-CCGAAGCTT TTAGTGGTGATG，其 5′端引入限制性内切酶HindIII位点（下划线部分）及保护性碱基。PCR体系为 50 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min；98℃变性10 s，56℃退火30 s，68℃延伸70 s，共33个循环；最后68℃延伸7 min。回收扩增获得的DNA条带，采用NdeⅠ/HindIII 双酶切后与经过相同处理的 pET30a（+）载体连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的质粒送中美泰和公司测序，将测序正确的质粒命名为pET30a-GETXm2。

1.4 重组蛋白的表达与鉴定

将 pET30a-GETXm2质粒转化 BL21（DE3）感受态细胞，分别在15℃和37℃条件下用IPTG诱导表达，收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况及其可溶性，将表达的重组蛋白称为rETXm2。采用Western blot方法，以抗His标签蛋白抗体为一抗，对重组蛋白做进一步的鉴定。

1.5 重组蛋白的纯化与鉴定

按照 Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，-80℃保存备用。将纯化后的目的蛋白（0.5μg）经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，以D型产气荚膜梭菌抗血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗进行孵育，按照底物显色试剂盒说明书进行显色，检测纯化的重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应情况。

1.6 重组蛋白的毒性分析

1.6.1 细胞毒性试验 将MDCK细胞接种96孔细胞培养板，置37℃、含5% CO2的培养箱中培养至形成细胞单层后，弃细胞生长液。将rETXm2用细胞维持液稀释至 100 μg·mL-1以及 10μg·mL-1，每个稀释度各接种3孔细胞，每孔100μL，置37℃、含5% CO2的培养箱中培养24 h，观察并记录细胞的病变情况。同时将肉肝胃酶消化汤和洗脱液用细胞维持液稀释100倍后，分别孵育细胞，作为阴性对照组，将 D型产气荚膜梭菌C60-2株天然毒素做2000倍稀释后作为阳性对照。

1.6.2 小鼠的毒力测定 已有的研究发现，产气荚膜梭菌ETX毒素首先以前体毒素形式分泌，当被蛋白酶，如胰酶、糜蛋白酶以及羧肽酶等，切除N端以及C端相应的氨基酸后，毒素被活化，从而发挥相应的生物活性[21-23]。活化的ETX对小鼠的半数致死量可达50 ng·kg-1[28]。本文按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）[26]规定的方法，用终浓度为1%的胰酶对纯化的rETXm2在37℃条件下活化1 h。将16—18 g的ICR小鼠随机分为9组，每组5只。分别用活化前和活化后的rETXm2进行尾静脉注射，注射剂量分为 0.001 mg（0.0625 mg·kg-1）、0.01 mg（0.625 mg·kg-1）、0.1 mg（6.25 mg·kg-1）3 个注射剂量。同时设置胰酶消化液（终浓度为1%）以及蛋白溶解液两个阴性对照和1个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌天然毒素阳性对照。样品均用明胶缓冲液进行稀释，注射的液体总体积为200μL，观察2d，记录小鼠的存活状态。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 免疫程序 合适浓度的纯化 rETXm2与Montanide ISA 201佐剂以1:1（v/v）的比例配制成rETXm2终浓度为 50 μg·mL-1的疫苗，另取灭菌 PBS 与Montanide ISA 201佐剂以1:1（v/v）的比例制备对照疫苗，置4℃保存备用。选用体重1.5—2.0 kg健康家兔，测定免疫前每只家兔血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。取8只对D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价为0的家兔，其中4只分别颈部皮下注射疫苗，2.0mL/只，免疫14 d后，以相同剂量、相同途径进行第二次免疫。另外4只以相同剂量、相同途径和相同方法免疫对照疫苗作为对照组。

1.7.2 血清中和抗体效价测定 分别在一免后 14 d以及二免后21 d，对试验组及对照组所有兔经耳缘静脉采血，分离血清备用。按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）3部中规定的方法测定血清中和效价[29]。

1.7.3 攻毒试验 二免后21 d，对免疫组及对照组所有家兔经耳缘静脉各注射 1 MLD的天然毒素进行攻毒，观察5 d，记录家兔的死亡情况。根据免疫组及对照组家兔的死亡情况，判定试验疫苗的免疫保护效力。

2 结果

2.1 ETX毒素突变体原核表达载体的构建

采用引物GETXm2-F/GETXm2-R进行PCR扩增，扩增片段经酶切后克隆至pET-30a（+）载体上。获得的重组质粒经双酶切后电泳观察，结果如图1所示。酶切后出现大小约5 kb的载体DNA片段，以及大小约920 bp的目的基因片段，与预期相符。测序结果表明，插入的外源基因序列正确，将此重组质粒命名为pET30a-GETXm2。

图1 原核表达重组质粒pET30a-GETXm2的酶切鉴定Fig. 1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pET30a-GETXm2

2.2 ETX毒素突变体的原核表达鉴定

将pET30a-GETXm2转化至BL21（DE3）感受态细胞并诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示，表达的重组蛋白rETXm2分子量约为39 kD，大小与预期相符。rETXm2在 BL21（DE3）菌体中以可溶性和包涵体两种形式表达（图2）。图2-a为rETXm2的SDS-PAGE鉴定结果。如图所示，rETXm2在15℃和37℃条件均有较高水平的表达，且rETXm2在15℃条件下可溶性表达比例大于后者。综合考虑 rETXm2的表达量、可溶性及诱导时间等，可以确定rETXm2的最适诱导表达条件为37℃，诱导表达4 h，收获细胞裂解上清。灰度扫描结果显示，该诱导条件下的可溶表达蛋白比例可达 30%。图2-b为重组蛋白的Western blot鉴定结果，如图所示，重组蛋白能与抗His标签抗体发生反应，证明目的蛋白含有His标签，与预期相符。

图2 rETXm2的原核表达与鉴定Fig. 2 Prokaryotic expression and identification of rETXm2

2.3 rETXm2的纯化与鉴定

如图3所示，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对 rETXm2进行纯化，收集纯度较高的洗脱液（50 mmol·L-1Imidazole 以及 300 mmol·L-1Imidazole的洗脱液）进行透析，最终获得的蛋白浓度为 1.2 mg·mL-1，纯度可达90%以上。将纯化后的rETXm2经SDS-PAGE后转印到 PVDF膜上进行 Western blot检测。结果显示，rETXm2能够与D型产气荚膜梭菌抗血清反应（图4）。

2.4 rETXm2的毒力测定

2.4.1 对MDCK细胞的毒力测定 MDCK细胞加入各组分后继续培养24 h，显微镜下观察。结果如图5所示，2 000倍稀释的天然D型产气荚膜梭菌毒素接种细胞组出现了明显的细胞病变（图5-a）；接种浓度为100 μg·mL-1和 10 μg·mL-1的 rETXm2蛋白试验组（图5-b）、接种肉肝胃酶消化汤和洗脱液的阴性对照组及空白对照组细胞均生长良好，未出现细胞病变（图5-c）。

2.4.2 对小鼠的毒力测定 结果如表1所示，rETXm2注射组、蛋白溶解液以及胰酶消化液两个阴性对照组小鼠，在注射后24 h均存活，未见任何异常，而注射1个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素的小鼠，在注射后24 h内全部死亡，说明rETXm2减毒成功。

图3 rETXm2的纯化Fig. 3 Purification of rETXm2

图4 rETXm2与 D型产气荚膜梭菌抗血清反应的 Western blot鉴定Fig. 4 Interaction of rETXm2 with antitoxin serum ofClostridium perfringens type D

图5 rETXm2对MDCK细胞的影响Fig. 5 The influence of rETXm2 to MDCK cell

表1 注射rETXm2小鼠的存活情况Table 1 Survival of mice challenged with rETXm2

2.5 rETXm2的免疫原性分析

2.5.1 抗 rETXm2兔血清的毒素中和抗体效价测定如表2所示，经血清中和法测定，以rETXm2免疫家兔后，每毫升的一免抗血清可中和 450—750个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和2 500—4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素，而佐剂对照组的兔血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用。以上试验结果表明，rETXm2的免疫效力远高于现行《中华人民共和国兽药典》规定的标准（30个小鼠MLD/mL），是优良的制苗用候选抗原。

2.5.2 攻毒保护性试验 在二免后 21 d，对所有rETXm2免疫组和佐剂免疫对照组的家兔，经耳缘静脉注射1个家兔MLD剂量的天然毒素进行攻毒，结果如图1所示，佐剂免疫对照组家兔在攻毒后5 d内全部死亡，rETXm2免疫组家兔全部健活，未见任何不良反应。

表2 rETXm2免疫兔血清的中和效价和免疫保护Table 2 Neutralizing titers of rabbit antiserum against rETXm2 and immuno protection of rETXm

3 讨论

作为一种潜在的生物武器，ETX的毒力仅次于肉毒毒素和破伤风毒素，可引起家禽和家畜特别是反刍动物强烈的肠毒血症，给畜牧业造成严重的经济损失[1-4]。因此，实现ETX的减毒乃至无毒的同时保留其免疫原性，进而制备适当的疫苗等生物制剂，具有经济性和生物安全性两方面的重要意义。李箐[24]等通过原核系统获得的可溶性重组 ETX具有较强的毒力，导致野生型重组ETX在该毒素亚单位疫苗的制备过程中同样存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患。

在无毒重组 ETX亚单位疫苗的研究中，作为经典的无细胞毒性突变体，rETXH106P的安全性和免疫原性已经得到大量的验证[20-22]。李箐[24]等对ETX的第106位组氨酸、第111位色氨酸及第199位苯丙氨酸的突变体进行了研究。结果表明，rETXH106P的安全性最高，其次为 rETXF199E。其获得的野生型重组ETX（rETX）对MDCK细胞的半数细胞致死浓度（CT50）为 37.73± 12.55ng·mL-1，而浓度为 100 μg·mL-1的 rETXH106P对 MDCK 细胞仍无毒力，rETXF199E的细胞毒力则为 rETX的1/2527。本文同时突变以上两个氨基酸位点，获得rETXm2，其细胞毒性检测结果进一步支持了该结论。然而，已有的研究发现，rETXH106P的可溶性表达量非常低（小于5%）[24,30]，不利于大量生产及纯化。而本研究中的rETXm2可溶性表达量较高，这可能是由于本研究按照大肠杆菌偏爱的密码子，对 rETXm2进行了优化。根据已有的文献报道，50 ng·mL-1的天然ETX即可引起小鼠死亡，而本研究发现，以 6.25 mg·kg-1剂量的 rETXm2尾静脉注射ICR小鼠后，小鼠全部存活（5/5），证明rETXm2具有良好的安全性。

自然环境中对动物致病的梭菌种类较多，且常混合感染，因而梭菌病的预防多采用联苗，以达到一针多防的目的。目前我国该类商品化疫苗均为天然毒素经甲醛脱毒后制备的类毒素疫苗，生产过程中需采用肉肝胃酶消化汤等天然成分较多的培养基，易导致产毒不稳定，难以保证批间一致性。此外，其抗原成分复杂，有效抗原含量较低，导致各菌株的类毒素免疫剂量均较高，制备联苗后免疫剂量过大，容易引起动物的应激反应。如曾经广泛使用的“羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症四联灭活疫苗”，因免疫剂量为每只羊5 mL，现已难以被养殖户所接受。根据《中华人民共和国兽药典》（2015年版）三部的规定，在此类疫苗检验中，对D型产气荚膜梭菌毒素的兔血清中和效价达到 3个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素（30 MLD·mL-1）即可判为合格。虽然该标准为疫苗的最低标准，但从中国兽医药品监察所历年的兽用生物制品监督检验结果来看，目前我国该类疫苗的免疫效力不容乐观，疫苗抽检不合格的情况时有发生（http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055. htm）。彭小兵等对自 2006—2015年间的此类疫苗检验结果的统计发现，以血清中和法检验后效力不符合规定的产品共有33批，其中β毒素组分效力不符合规定的比例最高，约为 72.7%[31]。然而，鉴于此类联苗免疫剂量的限制，无法再大程度增加β类毒素的比例。为此，产气荚膜梭菌毒素亚单位疫苗的研制显得极为重要。在一定的范围内，可以最大幅度地增大免疫原性较差的毒素抗原（如β类毒素），从而提高联苗的总体免疫保护作用。而本研究中制备的rETXm2一免兔血清每毫升可中和450 MLD以上，二免兔血清每毫升可中和2 500 MLD以上，效果明显优于目前的商品化疫苗。

4 结论

对D型产气荚膜梭菌C60-2株的ETX编码基因进行突变和密码子优化，通过基因合成获得了含有H106P和 F199E两个氨基酸突变的 ETX编码基因GETXm2，经原核系统表达并纯化，获得可溶性比例达 30%的重组蛋白 rETXm2。该蛋白在本研究的检测范围内同时失去了对MDCK细胞和小鼠的毒力，但仍保留了良好的免疫保护性，从而为我国现行 D型产气荚膜梭菌毒素疫苗升级换代提供了的理想候选疫苗抗原。

[1]郑晓丽, 窦贤明, 胡道俊, 肖勇, 赵翠荣, 倪学勤. 产气荚膜梭菌对养牛业的危害及其防制. 中国畜牧兽医, 2010, 37(8):211-214.ZHENG X L, DOU X M, HU D J, XIAO Y, ZHAO C R, NI X Q. The threat , prevention and control ofClostridium perfringensin cattle industry.China Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2010,37(8):211-214. (in Chinese)

[2]钏有科, 肖啸, 濮永华, 龚兴建. 努比亚山羊产气荚膜梭菌病的诊治. 中国兽医杂志, 2014, 50(12): 42-43.CHUAN Y K, XIAO X, PU Y H, GONG X J. Diagnosis and treatment ofClostridium perfringensinfection in Nubian goats.Chinese Journal of Veterinary Medicine, 2014, 50(12):42-43.(in Chinese)

[3]VAN I F, DE B J, PASMANS F, HUYGHEBAER G,HAESEBROUCK K, DUCATELLE R.Clostridium perfringensin poultry: an emerging threat for animal and public health.Avian Pathology, 2004, 33(6):537-549.

[4]郑晓丽, 宋振银, 倪学勤. 产气荚膜梭菌对家禽业的危害及其预防.中国家禽, 2008, 30(24): 69-71.ZHENG X L, SONG Z Y, NI X Q. Hazards and prevention ofClostridium perfringensto poultry industry.China Poultry, 2008,30(24):69-71.(in Chinese)

[5]REVITT-MILLS S A, ROOD J I, ADAMS V.Clostridium perfringensextracellular toxins and enzymes: 20 and counting.Microbiology Australia,2015, 36(3): 114-117.

[6]LI J H, Adams V, Bannam T L, Miyamoto K, Garcia J P, Uzal F A, Rood J L, McClanea B A. Toxin plasmids ofclostridium perfringens. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2013,77(2): 208-233.

[7]MCCLAIN M S, COVER T L. Functional analysis of neutralizing antibodies againstClostridium perfringensepsilon-toxin.Infection and Immunity,2007, 75(4):1785-1793.

[8]LEWIS M, WEAVER C D, MCCLAIN M S. Identification of small molecule inhibitors ofClostridium perfringensepsilon-toxin cytotoxicity using a cell-based high-throughput screen.Toxins, 2010,2(7):1825-1847.

[9]DORCA-AREVALO J, SOLER-JOVER A, GIBERT M, POPOFF M R, MARTIN-SATUE M, BLASI J. Binding of epsilon-toxin fromClostridium perfringensin the nervous system.Veterinary Microbiology,2008, 131(1-2):14-25.

[10]POPOFF M R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.FEBS Journal, 2011, 278(23):4602-4615.

[11]FINNIE J W. Neurological disorders produced byClostridium perfringenstype D epsilon toxin.Anaerobe, 2004, 10(2): 145-150.

[12]SAYEED S, LI J H, MCCLANE B A. Virulence plasmid diversity inClostridium perfringenstype D isolates.Infection and Immunity, 2007,75(5):2391-2398.

[13]HUNTER S E, CLARKE I N, KELLY D C, TITBALL R W. Cloning and nucleotide sequencing of theClostridium perfringensepsilontoxin gene and its expression inEscherichia coli.Infection and Immunity, 1992, 60(1):102-110.

[14]MINAMI J, KATAYAMA S, MATSUSHITA O, MATSUSHITA C,OKABE A. Lambda-toxin ofClostridium perfringensactivates the precursor of epsilon-toxin by releasing its N- and C-terminal peptides.Microbiology and Immunology, 1997, 41(7):527-535.

[15]FREEDMAN J C, MCCLANE B A, UZAL F A. New insights intoClostridium perfringensepsilon toxin activation and action on the brain during enterotoxemia.Anaerobe, 2016, 41: 27-31.

[16]ALVES G G, RA M D Á, CHÁVEZOLÓRTEGUI C D, LOBATO F C F.Clostridium perfringensepsilon toxin: The third most potent bacterial toxin known.Anaerobe, 2014, 30:102-107.

[17]COLE A R, GIBERT M, POPOFF M, MOSS D S, TITBALL R W,BASAK A K.Clostridium perfringensepsilon-toxin shows structural similarity to the pore-forming toxin aerolysin.Nature Structural and Molecular Biology, 2004, 11(8):797-798.

[18]NAGAHAMA M, ODA M, KOBAYASHI K, OCHI S, TAKAGISHI T,SHIBUTANI M, SAKURAI J. A recombinant carboxy-terminal domain of alpha-toxin protects mice againstClostridium perfringens.Microbiology and Immunology, 2013, 57(5):340-345.

[19]DAS S, MAJUMDER S, KINGSTON J J, BATRA H V. Generation and characterization of recombinant bivalent fusion protein r-Cpib for immunotherapy againstClostridium perfringensbeta and iota toxemia.Molecular Immunology,2016, 70:140-148.

[20]ALIMOLAEI M, GOLCHIN M, DANESHVAR H. Oral immunization of mice againstClostridium perfringens, epsilon toxin with aLactobacillus casei, vector vaccine expressing epsilon toxoid.Infection,Genetics and Evolution, 2016, 40:282-287.

[21]LI Q, XIN W, GAO S, KANG L, WANG J. A low-toxic site-directed mutant ofClostridium perfringenserfringens low-toxic site-directed mutant of Closenterotoxemia.Human Vaccines and Immunotherapeutics,2013, 9(11):2386-2392.

[22]DORCA-ARÉVALO J, PAUILLAC S, DLAZ-HIDALGO L,MARTÍN-SATUÉ M, POPOFF M R, BLASI J. Correlation betweenin vitrocytotoxicity andin vivolethal activity in mice of epsilon toxin mutants fromClostridium perfringens.PLoS One, 2014, 9(7):e102417.

[23]IVIE S E, MCCLAIN M S. Identification of amino acids important for binding ofClostridium perfringensepsilon toxin to host cells and to HAVCR1.Biochemistry, 2012, 51: 7588-7595.

[24]李箐.产气荚膜梭菌α、ε毒素突变体构建及应用[D]. 安徽: 安徽医科大学, 2013.LI Q. Construction of mutants ofClostridium perfringensAlpha,epsilon toxin and it’s application[D]. Anhui: Anhui Medical University,2013. (in Chinese)

[25]罗维佳, 邓晨, 李衍常, 高媛, 徐平. 串联杂种泛素结合结构域蛋白(ThUBD)在大肠杆菌中的可溶性高效表达. 军事医学, 2016,40(10):795-800.LUO W J, DONG C, LI Y C, GAO Y, XU P. Soluble expression of tandem hybrid ubiquitin-binding domains（ThUBD）In prokaryotic cytoplasm ofEscherichiacoliBL21(DE3).Military Medical Sciences,2016, 40(10):795-800. (in Chinese)

[26]于蕊, 王双, 余云舟, 俞炜源, 孙志伟. B型肉毒毒素保护性抗原He在大肠杆菌中的可溶性高表达. 生物技术通讯, 2008, 19(3):365-367.YU R, WANG S, YU Y Z, YU W Y, SUN Z W. High-level and soluble expression of Botulinum Neurotoxin serotype B protective antigen HC domain inEscherichiacoli. Letter in Biotechnology,2008,19(3):365-367. (in Chinese)

[27]黄保英, 王文玲, 王秀平, 蒋涛, 谭文杰, 阮力. 甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化. 病毒学报,2011(1):50-57.HUANG B Y, WANG W L, WANG X P, JIANG T, TAN W J,RUAN L. Efficient soluble expression and purification of influenza A nucleoprotein inEscherichiacoli. Chinese Journal of Virology,2011(1): 50-57. (in Chinese)

[28]BOKORI-BROWN M, SAVVA C G, FERNANDES DA COSTA S P,NAYLOR C E, BASAK A K, TITBALL R W. Molecular basis of toxicity ofClostridium perfringensepsilon toxin.FEBS Journal, 2011,278(23):4589-2011.

[29]中国兽药典委员会. 中华人民共和国兽药典2015年版三部. 北京：中国农业出版社，2016:45-46.Commission of Chinese Veterinary Pharmacopoeia. Veterinary Pharmacopoeia of the People’s Republic of China volume Ⅲ2015 edition. Beijing: China Agricultural Press, 2016:45-46. (in Chinese)

[30]OYSTON P C F, PAYNE D W, HAVARD H L, WILLIANMSON D,TITBALL R W. Production of a non-toxic site-directed mutant ofClostridium perfringensepsilon-toxin which induces protective immunity in mice.Microbiology, 1998, 144 (2):333-341.

[31]彭小兵, 田冬青, 彭国瑞, 李旭妮, 王蒙, 蒋玉文. 产气荚膜梭菌β毒素的表达及其抗血清的制备. 畜牧与兽医, 2015, 47(10):93-96.PENG X B, TIAN D Q, PENG G R, LI X N, WANG M, JIANG Y W.Expression ofClostridium perfringensβ toxin and preparation of its antiserum.Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2015, 47(10):93-96. (in Chinese)