补加可同化氮对冰酒发酵的影响

张雪,郭在力,俞志敏,张平,孙玉梅*

1(大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连，116034)2(辽宁太阳谷庄园葡萄酒业股份有限公司，辽宁 辽阳，111000)

葡萄中含有糖、有机酸、氨基酸、酚类、无机盐和维生素等多种营养物质，在葡萄酒发酵过程中，酵母菌利用这些营养物质生长、繁殖并代谢，生成具有一定风味特性的葡萄酒[1]。葡萄众多成分中，氮元素作用极其重要，直接影响酵母的细胞合成和多种物质代谢[2-3]。通常情况下，葡萄汁中的可同化氮含量在60～500 mg N/L之间，一般认为，完成正常酒精发酵的可同化氮含量不能低于140 mg N/L[4-5]。在葡萄酒发酵过程中，如果可同化氮质量浓度不足(小于140 mg N/L)，会出现发酵停滞或终止，以及生成H2S等现象；如果可同化氮含量过高(大于450 mg N/L)，则产生一些对葡萄酒风味不利的香气[6]。当可同化氮含量低于140 mg N/L时需要适量补加可同化氮以保证酒精发酵的正常进行。

目前，关于补加氮对葡萄酒发酵影响的研究较多[7-8]，但尚未见补加氮对冰酒发酵影响的研究报道。冰酒发酵的糖浓度较高，研究补加可同化氮对冰酒发酵的影响意义重大。本研究以威代尔葡萄汁为原料，通过补加氮源提高可同化氮含量，测定发酵过程中的理化指标，研究补加可同化氮对冰酒发酵的影响，从而为冰酒生产中补加可同化氮提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰葡萄汁：威代尔(Vidal)冰葡萄汁。酿酒酵母：酿酒酵母(活性干酵母)ST。添加剂：氮源(Thiazote®)、果胶酶、偏重亚硫酸钾、山梨酸钾，辽宁五女山米兰酒业有限公司。

1.2 仪器与设备

1.3 活性干酵母梯度驯化

ST酵母经梯度驯化之后制成种子液，然后接种到冰葡萄汁中进行发酵。驯化方法如下：将1 g ST酵母溶于10 mL无菌水，38 ℃恒温水浴培养15 min，每隔5 min轻微搅动1次，培养完成后得到一级活化液；取10 mL稀释到20 °Brix左右的冰葡萄汁，加入到一级活化液中，25 ℃恒温放置1 h，每隔30 min搅动1次，培养完成后得到二级活化液；取20 mL 40 °Brix左右的原始冰葡萄汁，加入到二级活化液中， 20 ℃恒温水浴培养2 h，每30 min搅动1次。得到40 mL ST酵母种子液。

1.4 冰葡萄酒酿造工艺流程

在装有750 mL冰葡萄汁的1 L葡萄酒瓶中，分别加入120 mg/L偏重亚硫酸钾和30 mg/L果胶酶，均接种15 mL ST酵母种子液，每组2个平行。酒瓶用棉塞封口，于18～20 ℃发酵48 h后，用发酵栓取代棉塞。当还原糖含量基本保持不变时，加入320 mg/L偏重亚硫酸钾和200 mg/L的山梨酸终止发酵。

1.5 测定方法

1.5.1 活酵母菌浓度测定

血球计数法[9]。

1.5.2 还原糖含量测定

DNS法[10]。

1.5.3 可同化氮含量测定

甲醛值法[10]。

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1.5.4 甘油含量测定

高碘酸氧化滴定碘法[11]。

1.5.5 挥发性组分含量测定

采用外标法，测出待测组分标准品的峰面积，并与对应的浓度绘制标准曲线。样品测定时，测出的各组分峰面积对应标准曲线，得到相应的样品组分浓度。

样品中的挥发性组分包括乙醇、乙酸、高级醇和酯类，采用顶空-气相色谱法(HS-GC)进行测定[12]。

(1)处理条件：向15 mL样品瓶中加入1.4 g NaCl、转子和7 mL发酵液，用PTFE垫密封，并置于磁力搅拌器上，在350 r/min条件下搅拌10 min。

(2)色谱条件：顶空进样条件：安捷伦7697A顶空进样器；平衡温度 90 ℃，定量环温度 100 ℃，传输管路温度110 ℃，平衡时间 30 min，采样时间0.5 min。

气相色谱条件：安捷伦 GC6850气相色谱仪，安捷伦DB-FFAP毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；汽化室温度 250 ℃，FID 检测器温度250 ℃，进样量2 μL。色谱柱初温40 ℃，稳定10 min，以5 ℃/min升至180 ℃，稳定 1 min，以20 ℃/min升至230 ℃，稳定2 min；空气流量300 mL/min，氢气流量 30 mL/min，载气(氮气)流量10 mL/min，分流比10∶1。

2 结果

2.1 补加可同化氮对活酵母菌数量的影响

图1显示在发酵的前2天，补加和不补加氮源组的活酵母菌数量都逐渐减少。可能是因为冰葡萄汁中的糖含量较高，且冰酒发酵是在低温下进行，酵母菌对于这样的环境不能立即适应，需要短暂的适应阶段，所以发酵的前两天活酵母菌数量减少。之后酵母菌逐渐适应环境并迅速的生长繁殖，并在发酵第5天达到最大生长。发酵16 d后，与不补加氮源组相比，补加氮源组的酵母菌活细胞数量下降较快，可能是产生了较多有害代谢物所致，WANG等[13]也得到了相同的结论。

图1 冰酒发酵过程中活酵母菌数变化Fig.1 The change of viable yeast cell concentrations during icewine fermentation

2.2 补加可同化氮对还原糖利用的影响

图2显示发酵的前2 d，补加和不补加氮源组的还原糖含量变化较小，可推测期间酵母菌都处于适应期。随着酵母菌对环境的适应程度不断提高，开始大量的生长繁殖，大量的还原糖被酵母菌利用，补加氮源组比不补加氮源组耗糖更快更多，前者在发酵17 d后还原糖含量基本不变，后者在发酵第19天之后基本不变。可见，补加氮源促进了发酵的进行，缩短了发酵时间。发酵结束时，2组残糖含量均大于125 g/L，符合冰酒的标准。

图2 冰酒发酵过程中还原糖含量变化Fig.2 The change of reducing sugar contents during icewine fermentation

2.3 补加可同化氮对可同化氮利用的影响

图3显示补加和不补加氮源组的可同化氮利用趋势大致相同。发酵前5 d，可同化氮含量大幅度下降至最低点；随后可同化氮含量趋于稳定；发酵20 d后，可同化氮含量上升。这是由于前期酵母吸收大量含氮物质，同时伴随着乙醇的生成，乙醇浓度较高时，会对细胞产生毒害作用，细胞通过关闭输送氮源的通道来防止乙醇的毒害作用[14]，因此，发酵中期可同化氮含量趋于稳定。发酵后期，一方面是因为酵母释放了细胞内的部分氨基酸以维持胞内的氧化还原平衡；另一方面，由于酵母菌自溶，胞内的氨基酸被释放出来，致使可同化氮含量上升，这与CHILDS等人[15]的研究结果一致。

图3 冰酒发酵过程中可同化氮含量变化Fig.3 Assimilable nitrogen contents during icewine fermentation

2.4 补加可同化氮对乙醇生成量的影响

图4显示，与不补加氮源组相比，补加氮源组生成乙醇更快。发酵20 d后，补加氮源组的乙醇含量基本保持不变，而不补加氮源组乙醇含量仍在增加，此时，补加氮源组乙醇含量为108.3 g/L，不补加氮源组乙醇含量为97.0 g/L。可见，氮源的补充促进了乙醇的生成，有利于缩短冰酒的发酵时间，更快达到要求的酒精度。

图4 冰酒发酵过程中乙醇产量变化Fig.4 The change of ethyl alcohol contents during icewine fermentation

2.5 补加可同化氮对甘油产量的影响

酵母菌在高糖环境中，生成了过量的NADH，对于厌氧发酵，通过生成甘油平衡氧化还原电位[6]。图5显示甘油的生成集中在发酵的前期和中期，补加氮源组的甘油生成较快，发酵14 d后甘油含量基本不变，而不补加氮源组甘油含量在发酵17 d后基本不变。由图5也可见，补充氮源不影响冰酒发酵的甘油最终产量，这与BELY等[16]得出的结论一致。

图5 冰酒发酵过程中甘油产量变化Fig.5 The change of glycerol contents during icewine fermentation

2.6 补加可同化氮对乙酸产量的影响

图6显示从发酵开始到结束，补加氮源组始终比不补加氮源组的乙酸产量高。乙酸产量受糖消耗速率的影响，补加氮源加快了糖的消耗，从而加快了乙酸的生成。研究表明，当可同化氮浓度较低时，补加氮源可以减少乙酸产量；当可同化氮浓度较高时，补加氮源会增加乙酸产量[17-18]。由于本研究的不补加氮源组可同化氮基础浓度较高，所以补加氮源会提高乙酸的产量。

图6 冰酒发酵过程中乙酸产量变化Fig.6 The change of acetic acid contents during icewine fermentation

2.7 补加可同化氮对风味物质产量的影响

图7显示高级醇的生成主要集中在发酵的前期和中期，正丙醇、异戊醇和异丁醇含量在发酵14 d达到最大值后基本不变；但是，2-苯乙醇含量在发酵前5天逐渐增加至最高，之后开始下降，可能是由于2-苯乙醇是某些产物的合成的前体物质，但尚未见到相关报道。在本实验中，补加氮源组的正丙醇、异丁醇和2-苯乙醇含量比不补加氮源组低，TORREA、VILANOVA等[19-20]也得出了相同的结论。异戊醇是由α-酮戊二酸合成的，补加氮源使糖的消耗量增加，α-酮戊二酸作为糖代谢的中间产物，其生成量会因糖代谢的加强而增加，最终导致异戊醇含量增加，这与秦伟帅等[21]的研究结果一致。不补加氮源组的最终高级醇总量，低于补加氮源组。研究表明，高级醇的总量小于等于300 mg/L时，高级醇的含量越高，葡萄酒的风味越复杂。2组高级醇总量均低于300 mg/L,因此补加可同化氮对葡萄酒的风味复杂性有益。

图7 冰酒发酵过程中高级醇产量变化Fig.7 The change of higher alcohol contents during icewine fermentation

图8显示补加可同化氮提高了除琥珀酸二乙酯以外的其他酯类的产量，这可能与乙酸或乙醇的产量增加有关。补加可同化氮降低了琥珀酸二乙酯产量，可能是由于作为琥珀酸二乙酯前体物质的琥珀酸，其生成量会受到糖代谢和糖代谢途径中琥珀酸之前的代谢产物消耗的影响，糖代谢途径中琥珀酸之前的代谢产物消耗较大，琥珀酸生成量就会减少，琥珀酸二乙酯的生成量也就随之降低[20]。补加氮源组的总酯含量比不补加氮源组高，葡萄酒的香气更强。

图8 冰酒发酵过程中酯类产量变化Fig.8 The change of esters content during icewine fermentation

3 结论

初始糖质量浓度426.96 g/L、可同化氮质量浓度347.49 mg N/L的威代尔冰葡萄汁，补加0.25 g/L的可同化氮能加快糖消耗，且消耗量提高3.23%，可同化氮的消耗量降低10.03%，乙酸、乙醇、高级醇和酯类物质产量显著提高，分别提高5.44%、4.65%、9.89%和11.38%，对甘油生成无影响。因此，适量补加可同化氮会影响发酵过程的参数变化，可以显著提高冰酒品质。适宜的可同化氮含量本课题没有研究，有待进一步实验研究。

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