软枣猕猴桃外植体消毒及继代增殖研究

李 强

（国营宽甸满族自治县黎明林场，辽宁 宽甸 118200）

软枣猕猴桃（Actinidia arguta）是辽宁山地地区著名的经济野果，其所含营养成分具有良好的保健作用，研究表明，软枣猕猴桃中的营养成分具有提高机体的免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等功效，果实所含营养成分是中华猕猴桃的几倍。因此，极具开发潜力，并且具有巨大的应用前景和推广价值。近年来，软枣猕猴桃主要采用嫩（硬）枝扦插和组织培养进行苗木繁育。由于组织培养技术不受自然环境和季节条件的影响，可以在一定时期内大量繁殖，因此能够很好的解决人们对软枣猕猴桃苗木的市场需求。在整个组培过程中，如何减少外植体的初培污染率和提高组培苗增殖系数是提高组培效率的两个关键因素，本研究就软枣猕猴桃外植体的灭菌消毒及继代增殖进行了研究，为今后软枣猕猴桃的工厂化组培育苗提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

6月中旬，剪取宽甸地区软枣猕猴桃基地2～3年生幼嫩枝条，带回实验室水培催芽20天，剪取新萌发和幼嫩的长势良好的腋芽及茎段为外植体，进行下一步的初代培养。

1.2 外植体的消毒灭菌

先剪取1.2～1.5厘米长的腋芽，再将茎段剪至3.0～5.0厘米，用流水冲洗1～1.5小时，再用无菌水冲洗3次。在无菌室的超净工作台上，先用75%乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3遍后，用0.1%的氯化汞将腋芽分别浸泡2、3、4、5分钟；茎段浸泡4、5、6、7分钟，之后用无菌水冲洗5次左右，无菌滤纸吸干水分后，将腋芽3剪至1.0～1.2厘米，茎段剪成1.5～2.0厘米的单芽茎段，接种于培养基上，每瓶种接种1个外植体，每个处理接种20瓶，重复3次。培养10天后观察两种外植体的污染情况并统计污染率，30天观察两种外植体的成活情况并统计成活率。

1.3 培养基的制备及培养条件

初代培养基为MS+2.0毫克/升6-BA+0.1毫克/升NAA；本研究通过丛生芽增殖途径和茎段扦插增殖途径进行继代增殖培养。将初代培养后无菌苗1.5厘米左右的顶芽接种到以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA（1.0、2.0、3.0毫克/升）和NAA（0.1、0.2、0.3毫克/升）组合的继代培养基中；将初代培养获得的无菌苗剪取1.5厘米长的茎段接种到以MS为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA（0.5、1.0、2.0毫克/升）和NAA（0.1、0.2、0.3毫克/升）组合的继代培养基中。以上每种处理均接种30瓶，每瓶接种1株，重复3次，所有培养条件均为：日光灯照明，培养温度为（25±2）℃，空气相对湿度50%～60%，光照时间13小时/天，光强为2000～3000Lx。培养30天后统计增殖系数。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时间对外植体接种效果的影响

在组培过程中，外植体的消毒是控制组培苗污染率的首要步骤，选择适宜的消毒剂，筛选最佳的消毒时间，才能获得生长良好的初代组培苗。本研究采用0.1%氯化汞溶液对软枣猕猴桃的腋芽和茎段两种外植体分别进行灭菌消毒处理，结果表明：随着灭菌时间的延长，几种处理的外植体的污染率均呈下降趋势。从表1可以看出，以腋芽为外植体的植株在灭菌时间为4分钟时成活率达到最高（84%），当灭菌时间为5分钟时，虽然污染率差异不明显，但成活率显著下降。因此，腋芽的灭菌时间在4分钟时为最佳，既可以很好的控制污染率，又具有很高的成活率。

从表2可以看出，随着灭菌时间的延长，以茎段为外植体的初代培养污染率随灭菌时间的延长成上升趋势，而成活率呈先上升，后下降趋势，在灭菌时间为5分钟时成活率达到最高（92.4%），污染率达到比较好的效果（6.1）。因此，以软枣猕猴桃茎段外植体在浓度为0.1%的氯化汞中灭菌5分钟为最宜。

2.2 不同激素浓度对软枣猕猴桃丛生芽增殖的影响

表1 灭菌时间对腋芽外植体培养的影响

表2 灭菌时间对茎段外植体培养的影响

芽的增殖和生长受细胞分裂素和生长素浓度比例的影响，细胞分裂素能刺激芽的分化，生长素控制芽的增长。由表3可以看出，不同浓度配比的6-BA和 NAA对芽增殖效果也不相同。6-BA浓度一定时，随着NAA浓度的增高，平均株高也随之增高；6-BA对芽的增殖系数影响较大，当6-BA为3.0毫克/升时，增殖系数达到最大（4.89），但在此浓度下，苗基部会偶有遇上组织产生，且玻璃化苗开始增多，故综合考虑，选择MS+2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA为最佳丛生芽增殖培养基，该培养基中的苗生长健壮，叶平展浓绿。

表3 不同浓度的6-BA和NAA对丛生芽增殖的影响

2.3 不同激素浓度对软枣猕猴桃茎段继代增殖的影响

由表4可以看出，6-BA和NAA对茎段继代增殖的影响与芽增殖表现比较一致，即6-BA浓度增加有利于芽的增殖，NAA浓度与芽增殖无线性关系，但可促进茎段的生长。当6-BA质量浓度为2.0毫克/升，NAA质量浓度为0.3毫克/升时，增殖系数达到最大为5.13，并且植株长势健壮，叶色浓绿，茎粗。因此，在茎段增殖培养中最佳的培养基为MS+2.0毫克/升6-BA+0.3毫克/升NAA。

3 结论与讨论

本研究使用软枣猕猴桃的腋芽和茎段为外植体材料，筛选了两种外植体的最佳消毒灭菌时间和适宜的继代增殖培养基，结果表明，腋芽最佳灭菌时间为4分钟，成活率达84%；茎段为5分钟成活率达到最高为92.4%，污染率均相对较低。通过观察发现，当灭菌时间过长时，成活率降低，这是由于消毒剂的处理时间过长，虽可降低污染率，但同时也会对植株造成一定的伤害，植株受损害后会变褐死亡。不同的外植体的消毒灭菌时间也有所不同，因此在接种前要进行必要的筛选。

表4 不同激素浓度配比对茎段继代增殖的影响

通过筛选，软枣猕猴桃的丛生芽最佳增殖培养基为MS+2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA，丛生芽的增殖系数为4.86，植株长势健壮，叶色浓绿，这与已有相关研究结果较为一致。6-BA和NAA的浓度较低时，无法满足植株对生长激素的需求。因此，会影响芽的增殖系数和长势，当6-BA和NAA的浓度过高时，茎段基部会出现愈伤组织，并有一定玻璃化苗产生，严重影响丛生芽的生长。因此，植物激素的使用浓度不宜过高。在茎段增殖途径中，虽然在2.0毫克/升6-BA+0.2毫克/升NAA的质量配比组合中在株高最高，但增殖系数较低，故综合考虑以M S+2.0毫克/升6-BA+0.3毫克/升 NAA为最佳增殖培养基。