鲍温样丘疹病皮损中朗格汉斯细胞与MCP-1的表达及意义研究

朱宁 周强 韩睿 程浩

鲍温样丘疹病（bowenoid papulosis，BP）是一种与高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染关系密切的疾病[1]，组织病理呈低度恶性原位鳞癌表现[2]。本病易复发，难以根治，被认为与机体免疫功能低下尤其是皮损局部抗病毒细胞免疫不足，不能建立对HPV有效的免疫应答有关，但具体发病机制尚未完全阐明。朗格汉斯细胞（LC）是参与机体皮肤和黏膜组织抗病毒感染的重要免疫细胞，可通过捕获与递呈病毒抗原启动对病毒的免疫应答。然而BP患者中HPV感染常呈持续状态，使得本病反复迁延不愈[3]，推测BP皮损局部可能存在LC某种功能受损。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）属于CC型趋化因子，对趋化LC自骨髓迁移至皮肤及LC分化成熟、抗原递呈等功能起重要作用，研究BP皮损局部MCP-1的表达有利于进一步了解LC功能受损的原因。目前关于BP皮损中LC及MCP-1的分布、形态及表达报道少见，LC在BP中的作用也尚未清楚。基于此，本研究采用免疫组化技术检测BP患者皮损及皮损旁正常皮肤组织中LC的标记分子CD1a及与其功能相关的MCP-1的表达，旨在探讨LC和MCP-1在BP发病机制中的作用，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2008年7月至2013年12月浙江大学医学院附属邵逸夫医院收治的36例BP患者的皮损蜡块，均符合BP临床诊断并经组织病理学检查确诊。其中男 26 例，女 10 例；年龄 21～64（33.06±10.38）岁；病程 1～36（7.33±8.00）个月。男性皮损部位包括龟头、冠状沟、包皮、阴茎、阴囊；女性皮损部位包括会阴、肛周、阴道口、大小阴唇等。患者均排除自身免疫性疾病、病毒性肝炎、结核及糖尿病等可能影响机体免疫力的疾病。本研究经医院和学校医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂 鼠抗人CD1a单克隆抗体、兔抗人MCP-1多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，即用型UltraSensitivTMS-P免疫组化试剂盒、二抗（生物素标记的羊抗鼠、羊抗兔）、DAB酶底物显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CD1a、MCP-1的免疫组化染色 分别取36例BP患者局部皮损和配对的皮损旁正常皮肤组织，标本经10%中性缓冲甲醇溶液固定，石蜡包埋，连续切片，厚度为4μm。采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法（SP法），按照试剂盒说明书操作，常规脱蜡，水化，抗原修复，依次滴加过氧化物酶阻断剂，封闭血清，分别用鼠抗人CD1a单克隆抗体、兔抗人MCP-1多克隆抗体进行免疫组化染色，以PBS代替一抗作为阴性对照，一抗工作液稀释浓度为1∶100，生物素标记的二抗，链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染并封片，光镜下观察并判定结果。

1.3.2 免疫组化染色结果判定

1.3.2.1 CD1a+LC的表达与计数[4]400倍光镜下观察，表皮、真皮内以细胞质和/或细胞膜着色呈褐色并有树突状突起的细胞为CD1a+LC，每张切片随机选取5个视野计数CD1a+LC细胞数和细胞总数，CD1a+LC密度=5个视野CD1a+LC细胞总数/5个视野总细胞数。

1.3.2.2 MCP-1的表达及半定量计分[5]400倍光镜下观察，以细胞质和/或细胞膜有棕褐色到淡黄色颗粒着色者为MCP-1阳性细胞，表达强度采用基于染色强度和阳性细胞百分率的半定量计分法。染色强度计分（A）：棕褐色计3分，棕黄色计2分，淡黄色计1分，未着色计0分；阳性细胞百分率计分（B）：≥66%的表皮细胞着色计3分；33%～65%的表皮细胞着色计2分；＜33%的表皮细胞着色计1分。MCP-1的表达强度为A×B。每张切片随机选取5个视野进行阳性细胞观察并予以半定量计分，取平均值作为400倍光镜下每个视野内MCP-1表达半定量计分结果（表达强度）。

1.4 观察指标 观察并比较BP皮损组织与皮损旁正常皮肤组织中CD1a+LC的形态、密度与MCP-1的表达情况，并分析CD1a+LC密度与MCP-1表达强度的相关性。

1.5 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用配对t检验；相关性分析采用Pearson相关；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BP皮损组织与皮损旁正常皮肤组织中CD1a+LC的形态、密度比较 CD1a分子主要表达于表皮棘层的树突状细胞，为细胞质褐色颗粒样着色，即为LC。BP皮损组织中CD1a+LC细胞体较小，突起明显减少、缩短，结果见图1a；而皮损旁正常皮肤组织中可见较多CD1a+LC，分布均匀，细胞体不规则，多数有较多较长树枝状胞突，结果见图1b。BP皮损组织中CD1a+LC密度为0.027±0.016，皮损旁正常组织中CD1a+LC密度为0.053±0.023，BP皮损组织中CD1a+LC密度明显低于皮损旁正常组织（P＜0.05）。

图1 BP皮损组织与皮损旁正常皮肤组织中CD1a+LC的形态比较（SP法，×400）

2.2 BP皮损组织与皮损旁正常皮肤组织中MCP-1的表达情况比较 MCP-1蛋白主要表达在表皮角质形成细胞的细胞质内，皮损组织中MCP-1染色以棕黄色至淡黄色为主，结果见图2a；皮损旁正常组织中MCP-1染色强度以棕褐色到棕黄色为主，结果见图2b。BP皮损组织中MCP-1的表达强度为2.361±1.710，皮损旁正常皮肤组织中MCP-1的表达强度为 4.833±2.324，MCP-1在BP皮损组织中的表达强度比在皮损旁正常皮肤中的表达强度明显降低（P＜0.05）。

图2 BP皮损组织与皮损旁正常皮肤组织中MCP-1的表达情况比较（SP法，×400）

2.3 BP皮损组织与皮损旁正常皮肤组织中CD1a+LC密度与MCP-1表达强度的相关性分析 MCP-1在BP皮损组织中表达强度较低，CD1a+LC密度也较低，两者呈正相关（r=0.372，P＜0.05），结果见图3。MCP-1在皮损旁正常皮肤组织中表达强度相对较高，且CD1a+LC密度也相对高，两者亦呈正相关（r=0.384，P＜0.05），结果见图4。

图3 BP皮损组织中CD1a+LC密度与MCP-1表达强度的散点图

图4 皮损旁正常皮肤组织中CD1a+LC密度与MCP-1表达强度的散点图

3 讨论

BP作为一种具有独立临床、病理特征的疾病，近年来发病率呈逐年上升趋势，BP发病机制研究因而被日益重视。LC是皮肤和黏膜内识别、处理和递呈抗原的专职免疫细胞，在HPV的免疫清除等方面具有特别重要的意义[6]。研究报道，HPV感染导致的宫颈癌[7]、鳞状细胞癌[8]等病变组织中LC受抑制，细胞数量减少，分布、形态等发生异常。

本研究检测了36例BP皮损和皮损旁正常皮肤组织中LC标志性抗原分子CD1a的表达，观察BP皮损组织中CD1a+LC分布密度和形态变化。与皮损旁正常皮肤组织相比，BP皮损组织中CD1a+LC密度降低，细胞体较小，突起明显减少、缩短。这提示BP皮损中LC数量下降、形态出现异常，可能导致LC的功能受损，如LC摄取表皮细胞内HPV抗原并向真皮淋巴结T细胞递呈抗原的能力下降，进而可能是BP病情反复或长期不愈的原因之一。

BP皮损局部LC密度和形态改变的机制目前尚未完全阐明。LC来源于骨髓，经血液/真皮迁移进入表皮。研究显示LC能否顺利进入表皮与表皮局部免疫微环境中细胞因子[9]，特别是趋化因子的诱导密切相关[10]。Caberg等[11]研究报道HPV感染引起的鳞状上皮病变中，LC的数量减少、功能受损。LC在病变局部的浸润受抑与环境中趋化因子缺乏有关。Feng等[12]研究发现HPV感染导致尖锐湿疣中LC数量减少的同时，形态亦出现异常，并认为LC形态的异常可能与上皮细胞产生的细胞因子影响LC成熟有关。

CC型趋化因子MCP-1主要由单核巨噬细胞、成纤维细胞等分泌产生，对LC的迁移和分化成熟，促进体内免疫微环境形成，诱导机体免疫应答等有重要作用[13]。Harada等[14]报道在免疫性胆道疾病中胆管上皮内LC的聚集与MCP-1在该处的表达有关。Ouwehand等[15]研究报道皮肤中使用MCP-1中和抗体能抑制LC的迁移。Kleine-Lowinski等[16]研究报道MCP-1的表达下调，可能导致宫颈上皮细胞对HPV的免疫耐受，从而促进宫颈癌的发生。

本研究发现，BP皮损组织中MCP-1染色淡，表达范围小，与皮损旁正常皮肤组织相比，MCP-1的表达强度下降。且BP皮损及皮损旁正常皮肤组织中，LC细胞密度与MCP-1表达强度均呈明显正相关。这提示BP皮损局部MCP-1的表达可能受抑制，使得机体免疫微环境中趋化LC向表皮HPV感染部位聚集的作用被减弱，可能是造成皮损局部LC密度降低的原因之一。

HPV感染引起MCP-1表达受抑制的具体机制尚不完全清楚。Hacke等[17]报道HPV感染引起的癌前病变以及恶变组织中，HPV通过影响p53进而抑制MCP-1的转录表达以及趋化细胞的功能。Sperling等[18]研究报道HPV8的E7蛋白通过转录因子C/EBPβ途径可抑制由角质形成细胞分泌与MCP-1同类的趋化因子CCL20的表达，进而影响了LC迁移。

综上所述，BP皮损组织中，HPV可能通过下调宿主MCP-1表达，使得皮损局部LC密度下降。此外MCP-1具有趋化单核巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞向炎性病变部位聚集、并诱导内皮细胞分泌黏附分子的能力亦减弱，使得这些细胞和细胞因子对LC功能的协同作用减弱，引起LC对HPV作出免疫应答的能力下降。LC在无法正常摄取HPV抗原的同时，分化成熟亦发生障碍，进一步造成抗原递呈功能障碍，最终导致机体免疫功能受抑制，难以形成对HPV有效的免疫应答，造成HPV持续感染。这些改变与BP的发生、发展、复发等病理过程密切相关。随着研究的深入，如能良好调控表皮局部MCP-1等趋化因子的表达水平，有效诱导LC向表皮迁移，可能在逆转BP免疫功能异常等医学难题方面产生积极影响。

[1]Li D,Dong B,Hu Z,et al.A Combined Assay of hTERT and E6 Oncoprotein to Identity Virus-Infection Keratinocytes With Higher Telomerase Activity in Human Papillomavirus 16 and 18-Related Bowenoid Papulosis[J].Am J Dermatopathol,2012,34(8):813-817.

[2]MarcucciC,Sabban EC,Friedman P,et al.Dermoscopic findings in bowenoid papulosis:report of two cases[J].Dermatol Pract Concept,2014,4(4):61-63.

[3]Zhou LL,Kang DH,Xu CX,et al.Expression of cyclin D1 and cyclin E significantly associates with human papillomavirus subtypes in Bowenoid papulosis[J].Acta Histochem,2013,115(4):339-343.

[4]Zhu Xiaoxia,Zhou Qiang,Cheng Hao,et al.Detection of Langerhans cells and plasmacytoid dendritic cells in condyloma acuminatum lesions of patients[J].Chin J Dermatol,2015,48(5):343-345.

[5]Shirotake S,Miyajima A,Kosaka T,et al.Regulation of monocyte chemoattractant protein-1 through angiotesin II type I receptor in prostate cancer[J].Am J Pathol,2012,180(3):1008-1016.

[6]Woodham AW,Raff AB,Da Silva DM,et al.Molecular analysis of human papillomavirus virus-like particle activated langerhans cells in vitro[J].Methods Mol Biol,2015,1249:135-149.

[7]Zivadinovic R,Petric AL,Goran L,et al.Persistent human papillomavirus infection in the etiology of cervical carcinoma:the role of immunological,genetic,viral and cellular factors[J].Srp Arh Celok Lek,2014,142(5-6):378-383.

[8]Pereira KM,Soares RC,Oliveira MC,et al.Immunohistochemical staining of Langerhans cells in HPV-positive and HPV-negative cases of oral squamous cells carcinoma[J].J Appl Oral Sci,2011,19(4):378-383.

[9]Eaton LH,Roberts RA,Kimber I,et al.Skin sensitization induced Langerhans'cell mobilization:variable requirements for tumour necrosis factor-α[J].Immunology,2015,144(1):139-148.

[10]Wang XQ,Gao XH,Hong YX,et al.Local hyperthermia decreases the expression of CCL-20 in condyloma acuminatum[J].Virol J,2010,7（1）:301.

[11]Caberg JH,Hubert P,Herman L,et al.Increased migration of Langerhans cells in response to HPV16 E6 and E7 oncogene silencing:role of CCL20[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(1):39-47.

[12]Feng JY,Peng ZH,Tang XP,et al.Immunohistochemical and ultrastructural features of Langerhans cells in condyloma acuminatum[J].J Cutan Pathol,2008,35（1）:15-20.

[13]Gupta M,Chaturvedi R,Jain A.Role of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)as an immune-diagnostic biomarker in the pathogenesis of chronic periodontal disease[J].Cytokine,2013,61(3):892-897.

[14]Harada K,Nakanuma Y.Innate immunity in the pathogenesis of cholangiopathy:a recent update[J].Inflamm Allergy Drug Targets,2012,11(6):478-483.

[15]Ouwehand K,Scheper RJ,de Gruijl TD,et al.Epidermis-to-dermis migration of immature Langerhans cells upon topical irritant exposure is dependent on CCL2 and CCL5 [J].Eur Immunol,2010,40(7):2026-2034.

[16]Kleine-Lowinski K,Rheinwald JG,Fichorova RN,et al.Selective suppression of monocyte chemoattractant protein-1 expression by human papillomavirus E6 and E7 oncoproteins in human cervical epithelial and epidermal cells[J].Int J Cancer,2003,107(3):407-415.

[17]Hacke K,Rincon-Orozco B,Buchwalter G,et al.Regulation of MCP-1 chemokine transcription byp53[J].Mol Cancer,2010,9(1):82.

[18]Sperling T,Oldak M,Walch RB,et al.Human papillomavirus type 8 interferes with a novel C/EBPβ-mediated mechanism of keratinocyte CCL20 chemokine expression and Langerhans cell migration[J].PLoS Pathog,2012,8(7):e1002833.