沉默β-catenin表达对黑色素瘤A375细胞增殖与凋亡的影响研究

杨跃 曹毅 刘伟 杨晓红

皮肤恶性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）多由痣或色素斑发展而来，一旦进入快速生长期，患者预后极差，平均生存期约30.3个月，且易发生转移、复发。CMM在皮肤恶性肿瘤死亡病例中占80%[1]。现已证明，信号转导通路在恶性黑色素瘤的发病机制中起至关重要的作用，提示干扰信号通路可能成为治疗恶性黑色素瘤的新途径[2]。Wnt/β-catenin是一条公认与肿瘤相关的信号通路，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡等生物学行为均密切相关[3]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信号通路中关键的效应器，其在细胞内表达水平的高低可反映Wnt信号通路的活化状态[4-5]。基于此，本研究旨在通过干扰慢病毒沉默黑色素瘤A375细胞中β-catenin蛋白的表达，探讨β-catenin蛋白对A375细胞增殖与凋亡的影响，以期为临床研制恶性黑色素瘤的治疗药物提供参考，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞 人恶性黑色素瘤A375细胞（以下简称A375细胞），购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂 鼠抗人β-actin单克隆抗体、兔抗人β-catenin单克隆抗体（美国abcam公司）；羊抗兔IgGHRP、羊抗鼠IgG-HRP（北京中杉金桥生物技术有限公司）；MTT、FBS、胰酶（美国 Gibco公司）；二甲基亚砜（北京Solarbio公司）；细胞凋亡试剂盒（南京凯基生物有限公司）；DMEM细胞培养基（北京全式金公司）。

1.3 主要仪器 自动酶标仪（芬兰雷勃公司）；荧光显微镜（日本OLYMPUS公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；蛋白电泳装置（美国BD公司）；细胞恒温培养箱（日本SANYO公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 A375细胞使用DMEM完全培养基常规培养，培养条件：5%二氧化碳、37℃恒温。细胞传代3次后用于实验。

1.4.2 慢病毒载体siRNA制作 慢病毒载体siRNA构建由上海吉玛公司负责包装。干扰β-catenin靶基因CTNNB 1 mRNA siRNA β-catenin-RNAi-LV 干扰序列：5′-GGATGTGGATACCTCCCAAGT-3′，并提供对应的慢病毒对照β-catenin-negative-LV，序列为：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4.3 慢病毒感染A375细胞 将A375细胞进行常规消化、离心、重悬后计数，将细胞悬液稀释至1×104/ml。将细胞接种于6孔板中，每孔2×104个，体积2ml。显微镜下观察细胞融合度约为30%～40%时，分别往对应的孔内加入病毒液3μl，8h后观察细胞状态，并给细胞换液，4d后荧光倒置显微镜下观察细胞荧光染色情况。经β-catenin-RNAi感染的A375细胞记作A375-RNAi细胞；经β-catenin-negative感染的A375细胞记作A375-negative细胞，作为阴性对照；未经任何病毒感染的A375细胞作为空白对照。当转染效率＞70%时，细胞分别继续传代、培养。

1.4.4 Western blot法检测细胞β-catenin表达水平常规细胞总蛋白提取后，进行蛋白电泳，转膜（200mA，90min），将NC膜在脱脂奶粉封闭1h，在一抗溶液中4℃过夜，TBST清洗3遍，将NC膜放入1∶2 500配置好的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗中室温下孵育1h。TBST清洗3遍，曝光，胶片晾干，扫描后应用Image J软件分析不同细胞中β-catenin蛋白表达水平的差异。

1.4.5 MTT法检测细胞增殖活性 分别将3组细胞制成0.75×104/ml的细胞悬液，接种于 96孔板，200μl/孔，培养24h，加入20μl/孔MTT工作溶液，4h后终止培养，加入150μl DMSO/孔，低速振荡10min，用酶联免疫检测仪测量各孔的吸光度值，48、72h后分别取出一块96孔板，按相同的步骤测量各孔的吸光度值并记录，吸光度值越大代表增殖活性越强。以上实验重复3次。

1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 分别将3组细胞消化、离心，用适量1×Buffer A重悬，制成1×106/ml的细胞悬液，加乙醇，于-20℃固定16h；1×Buffer A洗细胞2次，用0.25mg/ml RNaseA重悬，37℃作用30min；加PI 5μl，室温避光染色30 min；流式细胞仪激发波长488nm检测细胞凋亡率。

1.5 观察指标 观察并比较A375、A375-RNAi、A375-negative细胞倒置荧光显微镜下所见、β-catenin表达水平、增殖活性及凋亡率。

1.6 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件；计量资料以表示，3组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A375、A375-RNAi、A375-negative 细胞倒置荧光显微镜下所见比较 A375-RNAi细胞倒置荧光显微镜下见带绿色荧光，A375-negative细胞见带绿色荧光，未经任何病毒感染的A375细胞无荧光，说明A375-RNAi、A375-negative细胞慢病毒感染成功。

2.2 A375、A375-RNAi、A375-negative 细胞 β-catenin表达水平比较 见图1。

由图1 可见，A375、A375-RNAi、A375-negative 细胞β-catenin表达水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）。A375-RNAi细胞β-catenin表达水平较A375细胞与A375-negative细胞明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。A375细胞与A375-negative细胞β-catenin表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），β-catenin在A375细胞中高表达，β-catenin在A375-RNAi细胞中的表达量下降约55.1%，即β-catenin被干扰慢病毒液有效沉默。

2.3 A375、A375-RNAi、A375-negative 细胞增殖活性比较 见表1。

由 表1 可见 ，24、48、72h 时 ，A375、A375-RNAi、A375-negative细胞增殖活性比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。A375-RNAi细胞增殖活性较A375-negative细胞与A375细胞减弱（均P＜0.05），A375-negative细胞与A375细胞增殖活性比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 A375、A375-RNAi、A375-negative细胞 β-catenin 表达水平比较（a：蛋白电泳图比较；b：表达水平比较；与A375-negative细胞比较，*P＜0.05）

表1 A375、A375-RNAi、A375-negative 细胞增殖活性比较

2.4 A375、A375-RNAi、A375-negative 细胞凋亡率比较 见图2。

图2 A375、A375-RNAi、A375-negative细胞凋亡率比较（与 A375-negative 细胞比较，*P＜0.05）

由图2 可见，A375、A375-RNAi、A375-negative细胞凋亡率比较差异有统计学意义（P＞0.05）。A375-RNAi细胞凋亡率较A375-negative细胞与A375细胞明显增高（均P＜0.05)；A375-negative细胞与A375细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。A375-RNAi细胞凋亡率为（21.17±3.41）%。

3 讨论

恶性黑色素瘤是一种发展迅速、高侵袭性、易转移、易复发的肿瘤，现已成为皮肤常见恶性肿瘤之一。因患者对皮肤肿瘤重视程度不够，确诊时多属于中晚期，这也成为CMM预后极差、病死率极高的原因之一。

信号转导通路可揭示肿瘤发生、发展的分子机制。经典Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育和细胞内环境稳定，调控细增殖、分化及干细胞、祖细胞自我更新中起重要作用[6]。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白，它通过与酪蛋白激酶1α（CK1α）、糖原合成酶激酶 3（GSK 3）、腺瘤性结肠息肉病（APC）和轴蛋白（Axin）形成的降解复合体结合，使β-catenin磷酸化并降解[7-8]。β-catenin蛋白在细胞内异常聚集或高表达会持续激活Wnt信号[9]，可能使得信号通路中的其他分子发生突变，从而促进肿瘤的发展[10]。

RNAi技术能特异性剔除或关闭特定基因的表达以达到沉默靶基因目的，已成为一种功能非常强大的工具[8]。本实验所使用的慢病毒载体携带有绿色荧光蛋白基因，转染成功后在宿主细胞内显示绿色荧光；并能将靶基因片段融合至宿主基因内，能稳定的传递给子代细胞。通过观察带绿色荧光细胞比例及Western blot分析转染效率。结果显示，在倒置荧光显微镜下，A375-RNAi、A375-negative 细胞见带绿色荧光，A375-RNAi、A375-negative细胞慢病毒感染成功；Western blot显示A375-RNAi细胞内β-catenin的表达水平下调约55.1%，而A375-negative细胞无明显下调。这可以说明本实验运用慢病毒干扰成功沉默了β-catenin的表达。

Sinnberg等[11]利用 β-catenin干扰剂 PKF115-584作用于正常黑色素细胞和原位恶性黑色素瘤细胞WM35、WM115、WM793及转移性恶性黑色素瘤细胞451LU、SkMel28、1205LU、Mewo，结果显示：上述所有细胞在PKF115-584作用3d后细胞存活率均下降，并随PKF115-584浓度升高，细胞存活率下降。紧接着，Sinnberg等[11]又用慢病毒载体介导shRNA转染上述所有细胞，沉默β-catenin表达。在感染慢病毒2d后，检测细胞增殖情况，发现所有细胞增殖活性降低，且随感染时间延长，细胞存活率逐渐减低。此研究证实，无论是从干扰β-catenin表达还是阻断β-catenin转录活性，均会对恶性黑色素瘤细胞增殖起到抑制作用。

细胞凋亡过程主要受Bcl-2蛋白家族的蛋白调控。现已证实，Bcl-2基因是一个典型的原癌基因，在Bcl-2蛋白家族中，参与凋亡作用的主要是Bcl-2、Bax及Bak[12]。Bcl-2能通过阻断Bax和Bak活化而阻止细胞应对各种变化导致的凋亡。即Bax蛋白能促进细胞凋亡，而Bcl-2却能负调控细胞凋亡。研究发现，β-catenin作为转录因子能够调控Bax及Bcl-2蛋白的表达而参与凋亡过程[13]。c-Myc是一个公认的原癌基因，已经被证实是β-catenin的靶基因之一。c-Myc作为转录因子，是细胞内最重要转录因子之一，通过激活或抑制基因转录，最终能影响细胞增殖与凋亡，当缺乏营养剂生长刺激的情况下，c-Myc蛋白过表达，诱导细胞凋亡[14]。

综上所述，β-catenin转录活性提高是伴随恶性黑色素瘤发展，并可作为黑色素瘤细胞生存的标志之一。抑制β-catenin表达或活性可抑制细胞增殖、诱导抗凋亡基因下调，促进细胞凋亡，但其具体的作用机制有待于进一步的研究。

[1]Crocetti E,Mallone S,Robsahm TE,et al.Survival of patients with skin melanoma in Europe increases further:Results of the EURO-CARE-5 study[J].EuropeanJournalofCancer,2015,51(15):2179-2190.

[2]Merlino G,Noonan FP.Modeling gene-environment interactions in malignant melanoma[J].Trends in molecular medicine,2003,9(3):102-108.

[3]Nan S,Wang P,Yan L.Role of Wnt/β-catenin pathway in induc-ing autophagy and apoptosis in multiple myeloma cells[J].Onco-logy Letters,2016,12(6):4623-4629.

[4]Behrens J,von Kries JP,Kühl M,et al.Functional interaction of β-catenin with the transcription factor LEF-1[J].Nature,1996,382(6592):638-642.

[5]Chon E,Thompson V,Schmid S,et al.Activation of the Canonical Wnt/β-Catenin Signalling Pathway is Rare in Canine Malignant Melanoma Tissue and Cell Lines[J].Journal of Comparative Pathol-ogy,2013,148(2-3):178-187.

[6]Sinnberg T,Menzel M,Ewerth D,et al.β-Catenin signaling incr-eases during melanoma progression and promotes tumor cell su-rvival and chemoresistance[J].PloS one,2011,6(8):e23429.

[7]He H,Ding F,Li Y,et al.Migfilin Regulates Esophageal Cancer Cell Motility through Promoting GSK-3β-Mediated Degradation of β-Catenin[J].Molecular Cancer Research,2012,10(3):273-281.

[8]Wang J,Chen H,Cao P,et al.Inflammatory cytokines induce caveolin-1/β-catenin signalling in rat nucleus pulposus cell apop-tosis through the p38 MAPK pathway[J].Cell Proliferation,2016,49(3):362-372.

[9]Bellei B,Flori E,Izzo E,et al.GSK3β inhibition promotes melanogenesis in mouse B16 melanoma cells and normal human melan-ocytes[J].Cellular signalling,2008,20(10):1750-1761.

[10]Figeac N,Zammit PS.Coordinated action of Axin1 and Axin2 suppresses β-catenin to regulate muscle stem cell function[J].Cellular signalling,2015,27(8):1652-1665.

[11]Sinnberg T,Lasithiotakis K,Niessner H,et al.Inhibition of PI3KAKT-mTOR Signaling Sensitizes Melanoma Cells to Cisplatin and Temozolomide[J].Journal of Investigative Dermatology,2009,129(6):1500-1515.

[12]Long J,Menggen Q,Wuren Q,et al.MiR-219-5p Inhibits the Growth and Metastasis of Malignant Melanoma by Targeting BCL-2[J].Biomed Research International,2017,2017(9):1-7.

[13]Moon RT,Bowerman B,Boutros M,et al.The promise and perils of Wnt signaling through β-catenin [J].Science,2002,296(5573):1644-1646.

[14]Xia Y,Wu S.Tissue inhibitor of metalloproteinase 2 inhibits activ-ation of the beta-catenin signalling in melanoma cells[J].Cell Cy-cle,2015,14(11):1666-1674.