树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定

丁晨，肖红剑，龙琼，李智华，毕研伟，闫玲梅，李育中，姚月婷，寸韡

中国医学科学院 医学生物学研究所，云南 昆明 650118

1957年，英国科学家AiickIsaacs和IeanLin⁃denmann利用鸡胚绒毛尿囊研究流感病毒时，发现了一种可以抑制病毒增殖的物质，他们称之为干扰素（interferon，IFN）。干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学活性的细胞因子，是机体细胞在受到病毒、细菌内毒素以及其他诱生剂的刺激下，由受体细胞分泌的一种糖蛋白。IFN是一个含有许多种类的大家族，根据基因序列、染色体定位和受体特异性的不同，可分为3种类型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素[1]。

γ干扰素（IFNγ）是Ⅱ型干扰素，又称为免疫干扰素，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，能够激活NK等细胞，调节巨噬细胞、T细胞、B细胞之间的关系，增强免疫应答能力，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分,具有强大的免疫调节作用和抗病毒、抗肿瘤作用。由于IFNγ在机体体液免疫应答和免疫调控中的重要作用，其在临床中的应用倍受青睐[2]。

目前对人和小鼠的IFNγ都有一定的研究，但树鼩IFNγ的研究资料尚比较缺乏。氨基酸序列同源性和物种亲缘分析显示，除黑猩猩外，人与树鼩的序列相似度最高，达68%[3]。作为一种重要的新型实验动物，树鼩体型小、价格低、繁殖周期短，在一些特殊疾病模型上具有独特的优势，因而成为多种人类疾病研究的模型动物，在神经科学[4]、癌症[5]、感染与免疫[5-7]、视角系统缺陷[8]及生殖发育[9]等方面的研究中具有重要地位[10]。我们通过原核表达纯化树鼩IFN-γ，经免疫家兔后鉴定其免疫原性，并检测树鼩不同组织中IFNγ的分布，为进一步研究树鼩的IFNγ奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

树鼩由中国医学科学院医学生物学研究所实验动物中心提供；家兔购自云南楚商科技有限公司。动物均在本实验室按标准方法进行饲养和实验。树鼩麻醉处死后取心、肝、脾、肺、肾、气管、食管、鼻组织，标注后放置于液氮内备用。

大肠杆菌 DH5α感受态、BL21（DE3）感受态为本实验室保藏；载体pET30a（+）、pMD19-T购于TaKaRa公司；Q5超保真DNA聚合酶，限制内切酶NcoⅠ、HindⅢ购自 NEB 公司；TRIzol、逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自北京天根生化科技公司；同源重组酶购自Vazyme公司；镍柱购自GE公司；完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自Sigma公司；兔抗人IFNγ单克隆抗体购自Ab⁃cam公司；其余试剂为国产分析纯试剂；PCR引物及DNA测序由上海生工公司完成。

1.2 树鼩肺组织总RNA的提取及RT-PCR扩增IFNγ基因

无菌条件下取树鼩脾脏组织，用TRIzol法提取脾脏RNA。根据GenBank预测的树鼩IFNγ基因序列设计引物，逆转录获得cDNA。设计引物，以cDNA为模板扩增得到含有目的基因的片段。

1.3 质粒及载体构建

将表达载体 pET30a（+）用NcoⅠ、HindⅢ酶切后用胶回收纯化试剂盒纯化，PCR扩增IFNγ基因后用PCR产物纯化试剂盒纯化，然后将二者用同源重组酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在卡那霉素抗性平板上挑取阳性转化子的质粒进行鉴定，正确后转入表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，作为工程菌株。

1.4 重组蛋白表达

挑取阳性克隆至5mL含50ng/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，次日取1%体积转接至 2YT培养基中，37℃振荡培养 3～4h，加 1 mmol/LIPTG，30℃诱导培养4h后离心收集沉淀。对照组未转入质粒但其他培养条件相同。

1.5 包涵体蛋白的提取及纯化

1.5.1 包涵体蛋白提取 将菌体用预冷的20 mmol/LTris·HCl（pH8.0）缓冲液重悬后超声波破碎，离心收集沉淀，加入20mmol/LTris·HCl（pH8.0）（含1%TritonX-100）搅拌制成悬液，离心后沉淀加入 20mmol/LTris·HCl（pH8.0）（含1%TritonX-100、2mol/L尿素）搅拌制成悬液，再次离心，沉淀加入 20mmol/LTris·HCl（pH8.0）（含1mol/LNaCl）搅拌制成悬液，收集沉淀提取包涵体。

1.5.2 包涵体蛋白纯化及复性 用变性溶液［6 mol/L盐酸胍，0.5mol/LNaCl，1mmol/L β巯基乙醇溶液（pH8.0）］溶解包涵体，离心后取上清，经镍柱纯化。按标准操作流程操作，用0.5mol/L咪唑洗脱，按峰图分管收集样品。选择较纯的洗脱峰样品在 25mmol/LTris、0.1mmol/LGSSG、1 mmol/LGSH溶液中稀释复性。

1.6 抗体制备及免疫原性检测

将纯化复性后的IFNγ与弗氏佐剂乳化后免疫家兔（每只200μg/次），第一次免疫用弗氏完全佐剂与IFNγ乳化，第2、3、4次免疫用弗氏不完全佐剂与IFNγ乳化。每2周免疫一次，免疫方式为背部皮下3点注射。第4次免疫后采血并分离血清，ELISA检测抗体滴度，Western印迹检测树鼩心、肝、脾、肺、肾、气管、食管、鼻组织中的IFNγ抗体（一抗为分离的血清1∶5000，二抗为羊抗兔HRP1∶5000）。

2 结果

2.1 PCR扩增IFNγ基因及其表达载体的构建

以树鼩脾脏总RNA为模板进行PCR扩增，扩增产物大小与预期一致（479bp）（图1A）。构建的重组表达载体经HindⅢ酶切获得5573、256bp片段（图1B）。测序结果与GenBank中预测的树鼩IFNγ基因序列一致。

2.2 融合蛋白的表达

pET30a（+）-IFNγ和未转入质粒的空载体大肠杆菌转化子分别培养，30℃、1mmol/LIPTG诱导4h表达，经SDS-PAGE检测，目的蛋白相对分子质量约为24000。由图2可以看出，未转入质粒的空载体经诱导后未产生目的蛋白，而pET30a（+）-IFNγ经诱导后产生大量目的蛋白，重组IFNγ获得表达。

2.3 包涵体蛋白的提取及纯化

pET30a（+）-IFNγ诱导后的菌体依次经超声波破碎和1%TritonX-100、2mmol/L尿素、1 mmol/LNaCl溶液溶解离心，上清中未见目的蛋白，说明IFNγ融合蛋白以包涵体形式存在（图3A）。包涵体变性溶解后经镍柱纯化，结果如图3B，洗脱峰收集管1的目的蛋白条带较纯，进一步进行蛋白复性。

2.4 免疫原性鉴定

由图4A可见，与诱导前、后的pET-30a（+）载体及空载体对照相比，诱导前可检测出淡淡的特异性条带，而诱导后的菌体出现很强的特异性条带，证明免疫后得到针对IFNγ的特异性抗体。当抗体稀释率达到1∶10000，ELISA仍可检测出阳性结果。

为了进一步探讨IFNγ在树鼩不同组织中的分布情况，取树鼩不同组织匀浆后，以家兔免疫后血清为抗体进行Western印迹，结果见图4B，树鼩的鼻、气管、心、肝、肾及大部分肺叶中均能检测到IFNγ，而脾、食管及少部分肺叶组织中未能检测到IFNγ。

图1 IFNγ基因的PCR扩增（A）及其表达载体的酶切鉴定（B）

图2 IFNγ表达的SDS-PAGE检测

图3 IFNγ包涵体蛋白提取（A）及纯化（B）的SDS-PAGE检测

图4 Western印迹检测树鼩组织中的IFNγ抗体

3 讨论

IFNγ是可溶性糖蛋白，由于其基因序列、氨基酸个数以及有无信号肽的差别，不同物种的IFNγ差别也比较大。大部分物种的IFNγ都以同源二聚体或四聚体的形式存在，单体一般不具有活性。20世纪80年代初，人的IFN基因克隆成功后，各国学者相继开展了动物IFN的研究[1]。相对于其他哺乳类动物而言，树鼩作为实验动物主要有两大优势：第一，树鼩体型小、资源丰富、实验研究成本低，正在成为重要的常用实验动物；第二，无论分类地位如何，树鼩是最接近灵长类的实验动物。在研究人类重大疾病方面，树鼩更具有优势，其研究结果可能更好地模拟了人类某些疾病的生理病理变化。但是对树鼩进化地位、基因和有关蛋白的功能差异的探索还很有限，制约了其广泛应用。

原核表达重组蛋白具有操作简单、蛋白表达量高、易于大规模发酵生产等优点，因此本研究采用原核表达系统诱导表达树鼩IFNγ，获得大量以包涵体形式存在的目的蛋白。研究选用的表达载体pET-30a（+）带有2个His标签，为后期的蛋白纯化提供了方便。包涵体蛋白变性后采用His-tag亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的目的蛋白。经免疫家兔后，Western印迹分析和树鼩IFNγELISA检测显示蛋白产生了良好的免疫原性，并且在树鼩不同组织中检测到IFNγ的分布情况有差异，在树鼩的鼻、气管、心、肝、肾及大部分肺叶中均能检测到IFNγ，而在脾、食管及少部分肺叶组织中未能检测到。我们推断，在鼻、气管、肝和肾中检测到的IFNγ蛋白为同源二聚体结构。有关IFNγ的分布与其具有的生物学功能的相关联系还须进一步研究。

参考文献