海南黄芩中黄酮类化合物的分离与鉴定

刘洁，李备，刘春，陈露，梁扬，周玦飞，颜彦，陈赞民

1.海南省药品检验所，海南 海口 570216；2.海南省食品检验检测中心，海南 海口 570311

唇形科（Labiatae）黄芩属（Scutellaria）植物资源十分丰富，全世界共有300余种。该属物种多具有清热燥湿、泻火解毒之功效[1-2]。黄芩属植物具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、保肝、抗氧化等活性。现代化学成分研究表明，黄酮和二萜为其主要活性成分[3]。近十几年，有大量研究对从黄芩属植物中所得化学成分的活性进行筛选，发现了许多结构新颖且活性显著的化合物。海南黄芩（S.hainanensis）为唇形科黄芩属植物，分布于海南地区，长于石山上，是海南特有植物，具有清热解毒的功效[4]。迄今，有关海南黄芩化学成分研究的报道较少。在此，我们利用多种提取分离技术研究海南黄芩中的化学成分，并利用波谱学方法对所得化合物的结构进行鉴定，从海南黄芩中得到5种黄酮类化合物。

1 材料与方法

1.1 材料

所用植物于2014年8月采自海南省霸王岭，经鉴定为海南黄芩。

BrukerAVⅢ600型核磁共振仪；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水真空泵（河南巩义英峪予华仪器厂）；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；岛津LC-10AD二元低压半制备液相色谱仪；Agilent半制备色谱柱（Phenyl，2.5mm × 25.0cm，5 μm）；岛津20A高效液相色谱仪；薄层色谱预制板、柱色谱硅胶（100～200目，200～300目，青岛海洋化工厂）；SephadexLH-20（Healthcare公 司），HICHROM ApolloC18色谱柱（250mm × 4.6mm，5 μm）。

综上，微创低温等离子射频消融术联合低剂量放疗能缩短手术时间，减少并发症，降低复发率，促进患者发声功能恢复，提高术后生活质量，值得应用。

1.2 提取黄酮类化合物

干燥粉碎后的海南黄芩（5kg）用95%乙醇（20L）冷浸24h，然后采用加热回流进行提取。共提取3次，每次2h；减压回收溶剂，直至乙醇味消失；母液加水后，用石油醚萃取，继而采用氯仿萃取，浓缩后得到50g浸膏。

1.3 分离纯化黄酮类化合物

将氯仿萃取物进行硅胶柱色谱分析，用氯仿-丙酮梯度洗脱，合并后得到洗脱物Fr.A、Fr.B和Fr.C。Fr.B用硅胶柱色谱分离后，再进行凝胶柱色谱分离，采用反相高效液相制备色谱进行分离，得到化合物 1（12.0mg）、3（18mg）、5（23.0 mg）；Fr.C通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、反相高效液相制备色谱得化合物2（10mg）、4（9.0mg）。

1.4 测定黄酮类化合物纯度

称取5种化合物各约2mg，精密称定，分别至100mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，即得供试品。

色谱条件：HICHROMApolloC18色谱柱（250 mm × 4.6mm，5μm），流动相A为0.3%磷酸，流动相B为甲醇∶乙腈=2∶3，流动相A∶流动相B=40∶60；流速1.0mL/min，柱温 35℃，进样量 20 μL，检测波长280nm。

1.5 核磁测定方法

采用BrukerAVⅢ600型核磁共振仪，化合物1 溶剂为 CDCl3，化合物 2～5 溶剂为 DMSO-d6，1H-NMR为600MHz，13C-NMR为150MHz。

2 结果

2.1 化合物1结构鉴定

化合物1为无色油状物，HPLC归一化法测得纯度为 98.2%（图 1）。根据其1H-NMR（CDCl3，600 MHz）谱（图2），推断δ：12.20（5-OH），7.31（1H，t，J=8.4Hz，H-4′），6.60（2H，d，J=8.4Hz，H-3′，5′），6.08（1H，s，H-6），6.07（1H，dd，J=13.2，4.8Hz，H-2），3.88（3H，s，-OCH3），3.86（1H，dd，J=17.2，13.2Hz，H-3a），3.81（6H，s，2′，6′-OCH3），3.70（3H，s，-OCH3），2.56（1H，dd，J=17.2，4.8Hz，H-3b）。以上数据与文献[5]报道的 5-羟基-7，8，2′，6′-四甲氧基二氢黄酮基本一致，故确定化合物1为5-羟基-7，8，2′，6′-四甲氧基二氢黄酮。

2.2 化合物2结构鉴定

化合物2呈无色针晶状（甲醇），HPLC归一化法测得纯度为97.5%（图3）。根据其1H-NMR（DMSO-d6，600MHz）谱（图4），推断δ：12.50（1H，s，5-OH），7.86（1H，dd，J=8.4，2.4Hz，H-6′），7.61（1H，t，J=8.4 Hz，H-4′），7.26（1H，d，J=8.4Hz，H-3′），7.18（1H，t，J=8.4Hz，H-5′），6.76（1H，s，H-3），6.20（1H，s，H-8），3.91（3H，s，7-OCH3）。根据其13C-NMR（DMSO-d6，150MHz）谱（图5），推断δ：181.4（C-4），100.1（C-8），105.0（C-10），109.7（C-3），115.0（C-3′），120.4（C-1′），121.3（C-5′），128.7（C-4′），129.4（C-6′），133.6（C-6），150.2（C-7），156.8（C-2，C-2′），158.1（C-5），56.4（7-OCH3）。以上数据与文献[6]报道的5，6，7-三羟基-2′-甲氧基黄酮基本一致，故确定化合物2为5，6，7-三羟基-2′-甲氧基黄酮。

2.3 化合物3结构鉴定

化合物3为无色油状物，HPLC归一化法测得纯度为98.0%（图6）。根据其1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）谱（图7），推断δ：12.50（1H，s，5-OH），7.86（1H，dd，J=8.4，2.4Hz，H-6′），7.61（1H，t，J=8.4Hz，H-4′），7.26（1H，d，J=8.4Hz，H-3′），7.18（1H，t，J=8.4 Hz，H-5′），6.76（1H，s，H-3），6.20（1H，s，H-8），3.91（3H，s，7-OCH3），3.79（3H，s，2′-OCH3）。根据其13CNMR（DMSO-d6，150MHz）谱（图8），推断δ：181.4（C-4），100.1（C-8），105.0（C-10），109.8（C-3），115.0（C-3′），120.2（C-1′），121.3（C-5′），126.7（C-5′），129.4（C-6′），133.5（C-6），150.1（C-7），156.7（C-2，C-2′），158.1（C-5），56.4（7-OCH3），61.2（2′-OCH3）。 以上数据与文献[7]报道的5，2′-二羟基-6，7-二甲氧基黄酮基本一致，故确定化合物3为5，2′-二羟基-6，7-二甲氧基黄酮。

图1化合物1纯度测定液相色谱图

图2化合物1的1H-NMR谱

图3 化合物2纯度测定液相色谱图

2.4 化合物4结构鉴定

化合物4为无色油状物，HPLC归一化法测得纯度为 97.1%（图 9）。根据其1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）谱（图10），推断δ：13.00（1H，s，5-OH），7.92（2H，t，J=8.4Hz，H-2′，6′），7.52（3H，m，H-3′，4′，5′），6.50（1H，s，H-3），6.24（1H，s，H-8）。以上数据与文献[8]报道的黄芩素基本一致，故确定化合物4为黄芩素。

2.5 化合物5结构鉴定

化合物5呈无色片晶状，HPLC归一化法测得纯度为95.8%（图11）。根据其1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）谱（图12），推断δ：12.50（1H，s，5-OH），8.08（1H，d，J=15.6Hz，H-7），7.61（3H，m，H-3′，4′，5′），6.80（1H，s，H-3），6.29（1H，s，H-8），3.81（3H，s，7-OCH3）。以上数据与文献[9]报道的黄芩素7-甲醚基本一致，故确定化合物5为黄芩素7-甲醚。

图4 化合物2的1H-NMR谱

图5 化合物2的13C-NMR谱

图6 化合物3纯度测定液相色谱图

3 讨论

我们采用多种提取分离技术，并利用波谱学方法对所得结构进行鉴定，首次从海南黄芩中得到5种黄酮类化合物，分别鉴定为5-羟基-7，8，2′，6′-四甲氧基二氢黄酮（为多甲氧基二氢黄酮）、5，6，7-三羟基-2′-甲氧基黄酮、5，6-二羟基-7，2′-二甲氧基黄酮、黄芩素和黄芩素-7甲醚。这些化合物的获得丰富了海南黄芩化学成分组成，为其深入研究与开发提供了科学依据。

图7 化合物3的1H-NMR谱

图8 化合物3的13C-NMR谱

图9 化合物4纯度测定液相色谱图

图10 化合物4的1H-NMR谱

图11 化合物5纯度测定液相色谱图

图12 化合物5的1H-NMR谱