RP-HPLC测定祛风除湿膏中血竭素的含量

王佳茜，李俊强，赵凯丽，王磊

祛风除湿膏是由血竭、黄芪、当归等十五味中药组成，具有益气血，补肝肾，祛风湿，活血通络的功效，用于治疗风湿、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎。血竭为传统名贵中药，具有活血定痛、化瘀生肌的功效[1]。血竭素是血竭的主要有效成分之一，故本文以血竭素的含量为指标，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）建立了祛风除湿膏中血竭素含量的测定方法，为该制剂的质量控制提供了依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相液相色谱仪，SPD-20A型控制器；梅特勒托利多AE240电子分析天平；超声波处理器（昆山市超声仪器有限公司）。血竭素高氯酸盐对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110811-201506）；3批祛风除湿贴膏样品（市售)；乙腈、磷酸二氢钠为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Kromasil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm），流动相为乙腈-0.5 moL﹒L-1磷酸二氢钠溶液（41:59），检测波长440 nm，流速1 mL﹒min-1，色谱柱温度为25 ℃，进样量20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取血竭素高氯酸盐对照品9 mg，精密称定，置10 mL棕色量瓶中，加3%磷酸甲醇溶液使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得，每1 mL中含血竭素0.654 mg(血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量／1.377)。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密刮取膏药0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加3 %磷酸甲醇溶液50 mL，密塞，精密称重，75 ℃加热回流30 min，放冷，甲醇补足失重，摇匀，滤过即得。

2.2.3 阴性对照溶液 取除血竭以外的其他药材，按确定的制备工艺制备不含血竭的阴性对照样品，按照供试品溶液的制法制备阴性对照溶液。

2.3 含量测定

2.3.1 专属性考察 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照品溶液，注入液相色谱仪检测。结果表明，其他组分对血竭素测定结果无干扰。结果见图1。

图1 祛风除湿膏 HPLC图

2.3.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下血竭素高氯酸盐对照品溶液（相当于血竭素0.654 mg﹒mL-1）0.1, 0.2，0.4, 0.8, 1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。得浓度为6.5 µg﹒mL-1、13 µg﹒mL-1、26µg﹒mL-1、52 µg﹒mL-1、65 µg﹒mL-1的对照品溶液，如法测定，以血竭素高氯酸盐峰面积积分值为纵坐标（Y），对照品溶液浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归分析。结果回归方程为Y= 29081X-2534.1，相关系数r为0.9995。结果表明，血竭素浓度在6.5 µg﹒mL-1-65 µg﹒mL-1内线性关系良好。标准曲线见图2。

图2 血竭素高氯酸盐标准曲线

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液（26 µg﹒mL-1），重复测定6次。结果血竭素高氯酸盐峰面积积分值RSD=1.6 %，表明方法精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 吸取同一供试品溶液，分别于供试品溶液制备后的0，2，4，6, 8，12，24小时测定血竭素峰面积。结果血竭素峰面积积分值变异系数RSD=2.1 %，表明供试品溶液在24h内具有良好的稳定性。

2.3.5 重复性试验 刮取同一批祛风除湿膏的膏药，共6份，分别制得6份供试品溶液，如法测定。测得含量的RSD= 1.23 %，表明本方法重复性良好。

2.3.6 加样回收试验 取已知血竭素含量的祛风除湿膏膏药(血竭素含量为1.853 mg﹒g-1)，共6份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入血竭素高氯酸盐对照品溶液（相当于血竭素0.465 mg﹒mL-1）1 mL，按“2.2.2”项下方法制得供试品溶液。如法测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 血竭素加样回收试验

2.3.6 样品含量测定 取3批样品，按确定方法测定血竭素含量，结果3批样品每克含血竭素的平均含量分别为1.879 mg﹒g-1、1.876 mg﹒g-1、1.853 mg﹒g-1。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法优选时，采用3 %磷酸甲醇溶液作为溶剂，可使样品中的血竭素转变为血竭素的磷酸盐，增强其稳定性[2]。同时比较了3 %磷酸甲醇溶液超声30 min、60 min，加热回流30 min、60 min，结果表明加热回流30 min时，可较好的提取样品中的血竭素。

3.2 色谱条件优选时，参考已有文献[3-5]，试验了乙腈-0.5 mol﹒L-1磷酸二氢钠溶液（50:50, 45:50, 35:50）等不同的流动相比例，结果显示当比例为35:50时，目标峰分离度良好。为了缩短分析时间，最终确定流动相为乙腈-0.5 mol﹒L-1磷酸二氢钠溶液（41:59）。

[1]陈军霞,邱碧菡,潘林梅，等.血竭的现代研究[J].现代中药研究与实践,2011,03:81.

[2]窦金凤,曹云飞.HPLC测定活血壮筋丸中血竭素的含量[J].现代仪器,2009,02:32.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2015:142

[4]谭生建,贺业谦,梁爱君,等.HPLC测定通络止痛散中血竭素的含量[J].解放军药学学报,2012,06:514.

[5]蔡颖.HPLC测定龙血竭胶囊中血竭素的含量[J].药学进展,2004,08:376.