ATP发光法在日化产品抗菌抑菌快速检测方面应用的可行性研究

邱皓璞 张弛 王晓丽 朱荣

摘 要：以日化产品作为检测对象，以QB/T 2738-2012中对日化产品抗菌抑菌效果的检验方法为基础，通过ATP发光法与行业标准中悬液定量法的对比，对ATP发光法在快速检测日化产品的抗菌抑菌性的应用上的可行性及准确性进行评价。为国家对日化产品的监管提供新技术支持。

关键词：ATP发光法，快速检测，日化产品，抗菌抑菌性

在轻工行业标准QB/T 2738-2012中规定了日化产品中抗菌抑菌性的检测方法：悬液定量法和抑菌环法。但这两种方法都存在弊端，悬液定量法是利用细菌悬液进行常规微生物培养基培养后进行计数，耗时较长。抑菌环法则是使用量取抑菌环大小的方法来测定产品中的微生物指标，容易受外界影响，结果准确性低。

三磷酸腺苷（ATP）是一种存在于活着的所有生物细胞中的化学物质，活菌中含有一定量的ATP，如1个革兰氏阳性菌的ATP含量约为1*10-18 g，革兰氏阴性菌是阳性菌的10倍，而酵母又是革兰氏阴性菌的10倍。ATP、荧光素、氧气，在Mg2+存在的条件下与荧光素酶发生反应，进行发光。

由于其发光量根据ATP量的比例进行，因此可以通过测定发光量来测定生物由来的ATP量，其检出限在细菌数102～103 cfu/mL。有研究表明ATP发光量与活菌数之间有较好的线性关系，且其在细胞死亡后极易降解的特性，使其成为较好的活菌的检测指标。目前ATP发光法已经在国内外广泛应用于在牛乳、豆腐等无细胞食品和水质、工作台面等环境中活菌的检测。因此，在日化产品的抗菌抑菌性检测方面的应用也值得期待。

材料与方法

1 仪器与材料

1.1主要仪器：3MTMClean-TraceTMATP荧光检测系统（3M公司），3MTMClean-TraceTMATP水质采样棒（3M公司）

1.2其它仪器及试剂：高压灭菌锅（TOMY SX-700）、生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂SPX-250B-Z型MODEL SPX-250B-Z）、旋涡混合器、一次性灭菌平皿、1000μl，200μl移液枪及灭菌枪头、 营养肉汤（北京陆桥）、营养琼脂（北京陆桥）。

1.3实验菌种：大肠杆菌（E.coil） ATCC 25922（American type culture collection）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 6538（American type culture collection）

1.4检验样品来源：来自市场的不同品牌和种类的洗手液，洗涤剂，洗洁精等产品如宝洁，白猫，联合利华，雕牌，浪奇，绿伞，滴露，威露士，汰渍，蓝月亮，奥妙，超能，花王，奇强，舒肤佳，六神等著名日化品牌的产品。

2 方法

2.1 ATP发光法检测与悬液定量法的关联性判定

通过ATP荧光检测仪测定不同稀释梯度的菌种悬液，并将各组数据汇总统计。再将继续稀释至一定范围的菌种悬液用悬液定量法，36℃，48h培养后计算CFU值，与ATP发光值进行对比。

2.2 ATP发光检测方法与行业标准方法的对比试验

行业标准具体方法参照QB/T 2738-2012中的悬液定量法，制备细菌繁殖体悬液，用合适的中和试剂稀释菌种悬液样品，与待测样品反应后，稀释至相应的浓度，倒入培养基，同时进行对照实验。经过37℃，48h培养后，对平板上形成 的单菌落进行计数（cfu/mL）。

ATP发光法检测一定浓度的菌种悬液，加入待测抗菌抑菌产品，反应与悬液定量法相同时间，将ATP水质采样棒放入试管中取样，用ATP荧光检测仪进行读取数据。

3 数据处理与分析

将菌落计数方法测得的值及ATP方法测得值，按照（消毒前菌液浓度-消毒后菌液浓度）/消毒前菌液浓度，得出抑菌抗菌率。将行标方法计算的抑菌抗菌率与ATP方法计算的杀菌率进行pearson相关系数的计算。当p值<0.05，则判断2个方法的值相关，ATP发光法具有可行性，反之则无可行性。

结果

1 ATP发光法检测与悬液定量法的关联性判定

ATP发光值与活菌菌落数呈现良好的线性关系。如fig.1和fig.2所示，菌液在1*103～9*105cfu/mL浓度范围内，无论E.coil（R2=0.9999）还是S. aureus（R2=0.9998）

2 ATP快速检测法与悬液定量法计算抗菌抑菌性值对比

结果见表1。ATP发光方法计算的杀菌率的值与悬液定量法计算的值进行比较，peason相关系数分别为0.998（E.coil）和0.999（S. aureus），p值分别为0.000和0.000，小于0.05，表现出较强的相关性。

讨论

3MTMClean-TraceTM ATP荧光检测系统的有效菌液测定范围在1*103～9*105cfu/mL，比传统的ATP发光法测定的值相比，测定值与测定范围都较低，这应该与水质采样棒的采样方法相关。但与传统的ATP方法相同，运用ATP快速检测系统进行抗菌抑菌性的检测与悬液定量法得到的结果具有较高的相关性（p=0.000）。这是因为ATP快速检测系统，虽然在菌液浓度的有效测量范围上比ATP传统方法测得值低且范围小，但由于抗菌抑菌性的计算方式，因此在运用ATP快速检测系统测量抗菌抑菌性时，并不会对结果造成影响。且在检测时间上ATP快速检测系统可以在1分钟内完成抗菌抑菌性的检测，比传统的ATP发光法更加快速，而传统的悬液定量法至少需要48小时。在检测方法上， ATP快速荧光检测系统也比悬液定量法更为简便，可以同时进行大批量的检测，而悬液定量法由于操作上的局限性，步骤更为繁琐，也无法同时进行大批量操作。由实验结果可以看出，ATP 生物发光法比传统的悬液定量法更为快速、方便，可以应用于日化产品抗菌抑菌性的快速检测领域。

参考文献：

1） QB/T 2738-2012日化产品抗菌抑菌效果的评价方法 [ S]

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4） 连英姿，安静，李越等.ATP生物发光法快速测定生乳中细菌总数的研究[J].中国卫生检验杂志.2009.19（4）：839-840.

5）Kong R.Y.C.， Lee S.K.Y.， Law T.W.F.， et al. Rapid detection of six types of bacterial pathogens in marine waters by multiplex PCR[J]. Water Research，2002，36：2802-2812

6）Renaud Chollet， Sébastien Ribault. Bioluminescence – Recent Advances in Oceanic Measurements and Laboratory Applications[M]. 2012.5：99-115

项目名称：应用ATP发光法的日化产品抗菌抑菌检测方法研究

项目编号：KJ2014004

作者简介：

邱皓璞 1989.5 男 江苏南京 助理工程师 学士学位，研究方向：食品相关产品