氧化亚氮（N2O）熏蒸对木纳格葡萄贮藏品质的影响

许静，张磊，魏佳，张政，吴斌,3，李雪萍

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）（2.新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所，新疆乌鲁木齐 830091）（3.新疆农产品质量安全实验室，新疆乌鲁木齐 830091）（4.华南农业大学园艺学院，广东广州 510000）

木纳格葡萄（Vitis viniferaL. cv.Munage）是一种具有新疆地方特色的鲜食、晚熟葡萄品种之一，主要分布于天山南部和环塔里木盆地，以阿图什地区的品质最优[1]。木纳格葡萄营养价值丰富，深受消费者的青睐。但是，木纳格葡萄果皮薄，果浆丰富，含糖量高，在贮藏期间容易发生失重软化、果梗褐变和落粒以及腐烂等一系列问题，造成严重的采后损失[2]。这不仅给木纳格葡萄的贮藏、运销带来困难，造成经济损失，也制约了南疆木纳格葡萄向规模化、产业化推进。

氧化亚氮（Nitrous oxide，N2O）是一种化学结构，与CO2相似，在水中具有较高的溶解性和稳定性的气体，同时它也是土壤中脱氮细菌的产物[3～5]。N2O能抑制线粒体中细胞色素氧化酶C的活性，减少果实在成熟衰老过程中乙烯的释放，延缓果实的转色，维持果实的贮藏品质[4,6～9]。Qadir等[10]人发现，N2O 可以延缓接菌后苹果、草莓、番茄以及石榴的腐烂速度。Lichanporn等[11]人认为，N2O可以通过降低PAL、PPO活性，抑制龙宫果的褐变。课题组前期研究发现，一氧化氮（Nitric oxide，NO）在果实贮藏过程中也具有上述与 N2O 相同的功能[12～15]。我们推测，N2O 作为NO的衍生物，它可能与NO类似在果蔬采后生命活动中发挥了积极的作用。课题前期已经证实NO能够维持木纳格葡萄的贮藏品质，延缓果实的衰老[16]。目前，有关N2O处理对葡萄采后品质影响的报道相对较少。因此，本试验以木纳格葡萄为材料，采用N2O气体以间歇熏蒸的方式处理果实，研究N2O对木纳格葡萄采后贮藏品质及抗氧化酶活性的影响，在为葡萄采后保鲜技术提供新思路同时，也为N2O在园艺产品的应用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

木纳格葡萄采自新疆阿图什，采后用冷藏车运回新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所冷库，挑选大小均一，果梗鲜绿、无机械损伤、无病虫害的葡萄果实。置于（0±0.5）℃实验室冷库中进行预冷处理，预冷时间24 h。

丙酮、草酸、氢氧化钠、冰醋酸、无水醋酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾、聚乙烯吡咯烷酮、过氧化氢，天津市福晨化学试剂厂；抗坏血酸、酚酞，天津市北联精细化学品开发有限公司；2,6-二氯靛酚，上海源叶生物科技有限公司；愈创木酚，天津市光复精细化工研究所。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

N2O 气体(气体纯度为 99.8%)，广州世源气体有限公司；UV-2600紫外分光光度计，日本岛津有限公司；IKA®A11基本型研磨机，广州仪科实验室技术有限公司；GY-4硬度计，北京市兴光测色仪器公司；PAL-1数显折射仪，日本Atago公司；Centrifge 5810 R型高速冷冻离心机，德国Eppendorff公司。

1.3 处理方法

将试验材料随机分组，每筐葡萄果实重5.00 kg，每个处理为4筐，共计16筐。将葡萄置于30 L熏蒸装置中，分别采用20、50、100 μL/L的N2O在有氧条件下熏蒸处理2 h（每隔7 d熏蒸一次，共熏蒸10次）。处理结束后，筐外套入0.03 mm的PE袋并封口，置于(0±0.5) ℃的条件下贮藏，以不采用N2O间歇熏蒸处理为对照组。每隔10 d拍照、取样（每次为2.00 kg），并对理化指标和相关活性酶进行测定。

1.4 指标测定

可溶性固形物含量的测定采用PR PAL-1型数显折射仪测定；可滴定酸含量的测定采用酸碱滴定法[17]；相对电导率的测定采用电导仪测定法[18]；POD活性测定采用愈创木酚法[19]；APX活性测定参考Imahori[20]等人的方法；硬度的测定采用GY-4数显式果实硬度计；失重率、腐烂率和落粒率的测定采用称重法[16]。

1.5 数据处理

使用Sigma Plot 12.5软件作图，SPSS 19.5进行数据方差分析(ANOVA)并利用 Duncan法进行均值比较。p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 N2O熏蒸浓度的筛选

葡萄果实采后易受病菌浸染而腐烂变质，引起腐烂的致病菌主要以青霉(Penicillium sp.)、灰霉(Botrytis cinerea)等真菌为主[21]。由表1可知，未经N2O处理的木纳格葡萄果实腐烂较快，在贮藏20 d后发生腐烂现象，到第70 d，葡萄果实的腐烂率达到30.49%。经N2O处理的木纳格葡萄果实的腐烂率显著低于对照组（p＜0.05）。在贮藏 50 d 后，20 μL/L 和 100 μL/L N2O处理组的葡萄果实腐烂率分别为14.24%和13.21%，显著高于 50 μL/L 处理组（p＜0.05）。

直至贮藏结束，50 μL/L N2O处理组的葡萄果实腐烂率仅为17.37%。50 μL/L N2O抑制葡萄果实腐烂的效果要显著优于其他浓度（p＜0.05）。N2O是微生物有效生长抑制剂且能延迟微生物生长的滞后期，抑制乙烯的产生和作用[9,22]。木纳格葡萄在贮藏过程中较低的腐烂率、落粒率可能与N2O能够有效抑制真菌的生长和乙烯的产生有关；较低的腐烂率也可能是N2O非直接地增加了寄主的抗病能力[23]，这方面的研究有待进一步深入。

表1 N2O间歇熏蒸对木纳格葡萄腐烂率、落粒率、失重率的影响Table 1 Effects of intermittent fumigation of N2O on the decay rate, shattering rate and weight loss rate of Munage grapes

在贮藏期间，木纳格葡萄果实的落粒率总体呈上升趋势。第20 d不同程度的出现落粒果，20 μL/L和100 μL/L处理组的葡萄落粒率均超过10%，显著高于50 μL/L 处理组（p＜0.05）。在整个贮藏期间 50 μL/L处理组的葡萄落粒率显著低于对照组和其他处理组（p＜0.05）。表明50 μL/L N2O处理效果最佳，能有效的减少木纳格葡萄的落粒率。

失重率是评价葡萄水分含量的重要指标，水分含量高则果粒饱满，新鲜度高。失重率随着贮藏时间不断增加。至贮藏结束时，20 μL/L和100 μL/L处理组的葡萄失重率为2.60%和1.71%，而50 μL/L处理组仅为1.18%。说明50 μL/L的N2O熏蒸处理能较好的维持果实的失重率。较低的果实失重率可能是由于N2O抑制了线粒体呼吸链上细胞色素C氧化酶的活性，降低了呼吸速率[24]，从而抑制了木纳格葡萄采后的呼吸和蒸腾作用，减少了果实水分的散失和落粒现象的出现。果实的腐烂、落粒是严重影响木纳格葡萄表观品质及商品价值的重要因素。本研究中，N2O处理能显著延缓木纳格葡萄在贮藏过程中的腐烂和水分散失，减少落粒的发生，使木纳格葡萄维持较高的商品价值，其中50 μL/L N2O处理浓度最适宜，则后续实验处理组均在此浓度下进行。

2.2 N2O对木纳格葡萄硬度的影响

果蔬在成熟衰老过程中，果胶在果胶酶和酸、碱作用下水解，这是造成果实硬度下降的主要原因。

从图1可知：木纳格葡萄的硬度随着贮藏时间逐渐下降。对照组果实硬度在贮藏10 d后迅速下降，由8.8 N/cm2下降至6.4 N/cm2，而处理组果实的硬度在整个贮存期下降缓慢，直至贮藏结束硬度为6.6 N/cm2，处理组与对照组差异性显著（p＜0.05）。本试验发现，50 μL/L N2O处理能有效的维持木纳格葡萄果实贮藏过程中的硬度，这可能是由于N2O抑制了木纳格葡萄果实组织中影响软化相关酶[25]（果胶甲酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶）以及细胞壁代谢相关酶的活性。

图1 N2O对木纳格葡萄硬度的影响Fig.1 Effects of N2O on the hardness of Munage grapes

2.3 N2O对木纳格葡萄可滴定酸含量的影响

果实中的糖酸含量能直接反映果蔬的品质状况。可滴定酸含量是评价葡萄风味品质的一个重要指标，也是影响贮藏特性的主要因素之一[26]。从图2可以看出，对照组和N2O处理组木纳格葡萄中可滴定酸含量的变化趋势相似，均随着贮藏时间呈逐渐下降的趋势。虽然，N2O处理能够延缓果实中可滴定酸含量的降低。但与对照组相比，N2O处理对可滴定酸的延缓效果并不显著（p＞0.05）。

图2 N2O对木纳格葡萄可滴定酸含量的影响Fig.2 Effects of N2O on the titratable acid content of Munage grapes

2.4 N2O对木纳格葡萄可溶性固形物的影响

图3 N2O对木纳格葡萄可溶性固形物含量的影响Fig.3 Effects of N2O on the content of soluble solids in Munage grapes

从图3可知，在贮藏期间木纳格葡萄的可溶性固形物含量呈逐渐下降的趋势，对照组下降幅度较大，处理组则下降缓慢。在贮藏10 d后处理组果实显著延缓了葡萄可溶性固形物的下降（p＜0.05）。贮藏 50 d后对照组果实可溶性固形物下降速率急剧增加，处理组则推迟了10 d。至贮藏结束，对照组和处理组果实的可溶性固形物含量由最初的 21%下降至 14.5%和16.5%。50 μL/L N2O处理显著延缓了采后木纳格葡萄果实中可溶性固形物含量的降低，这与Benkeblia[8]等人在洋葱上的研究结果相似。N2O处理可能影响了葡萄果实的呼吸速率，从而减少了细胞内部营养物质的分解代谢，因此较好的保持了木纳格葡萄的糖酸含量。

2.5 N2O对木纳格葡萄相对电导率的影响

相对电导率是评价果实品质和耐贮藏性的重要指标，在果蔬后熟衰老的过程中，细胞内的电解质会向外渗透，引起电导率的增加[16]。由图4可知，木纳格葡萄的相对电导率整体呈上升趋势，在贮藏10 d后，处理组果实的相对电导率显著低于对照组（p＜0.05），贮藏期结束时，对照组果实的相对电导率由最初的7%上升到25%，处理组则为21%。实验结果表明50 μL/L的 N2O能有效的抑制葡萄果实冷藏期间细胞膜渗透性的增加，说明 N2O可降低植物细胞质膜的相对透性，使细胞膜的离子渗透减少，对细胞膜具有良好的保护或修复作用，从而延缓了果实的衰老。

图4 N2O对木纳格葡萄相对电导率的影响Fig.4 Effects of N2O on the relative conductance of Munage grapes

2.6 N2O对木纳格葡萄APX和POD活性的影响

图5 N2O对木纳格葡萄APX和POD活性的影响Fig.5 Effects of N2O on the activity of APX and POD of Munage grapes

APX可以清除植物体内的 H2O2，防止植物中叶绿素的降解和细胞组织的伤害[27]。由图5可知，在贮藏期间，对照组和处理组的木纳格葡萄 APX活性呈先上升后下降的趋势。处理组果实的 APX活性高峰在第10 d就出现了，比对照组早了10 d。在贮藏前30 d，处理组和对照组果实的 APX活性差异性显著（p＜0.05），贮藏后期则无显著性差异。

POD是果蔬中普遍存在的一种重要的氧化还原酶，它与果蔬的许多生理过程和生化代谢过程都有密切联系[28]。由图6可以看出，贮藏10 d后，木纳格葡萄POD活性迅速下降，对照组的POD活性缓慢上升，而处理组果实的POD活性则持续下降至50 d。贮藏20 d到60 d之间，处理组果实POD活性显著低于对照组（p＜0.05）。植物中木质素和木栓质的积累与POD活性增强有关[29]。N2O可能通过抑制葡萄果实中POD的活性来抑制木质素和纤维素的合成，推迟组织木质化，从而较好的保持了果实的贮藏品质。

POD和APX是植物在逆境条件下酶促防御系统的关键酶，能够清除植物体内的H2O2，使植物体内自由基维持在一个正常的动态水平，以提高植物抗逆性[2]。本试验研究结果显示，50 μL/L N2O能够抑制葡萄果实APX、POD的活性。这与程琳琳[30]、Lichanporn[11]研究的结果相一致。从上述指标中可看出50 μL/L N2O较好地维持了木纳格葡萄的贮藏品质，这也减少了葡萄果实的逆境防御生理生化反应，因此POD和APX的活性维持较低水平。NO对植物中活性氧水平具有双重调节作用，NO可以通过调节植物体内的活性氧代谢来减轻胁迫伤害，但NO在抑制线粒体活性的同时也可增强抗氰呼吸，避免因线粒体电子传递链而导致活性氧的积累[31]。N2O是NO的衍生物，由此可推测N2O可能通过抑制葡萄果实APX、POD的活性导致活性氧积累，活性氧水平高低与植物的抗病强弱直接相关，当植物受到病原微生物浸染后，活性氧水平快速增加引发过敏反应[32]。这也能较好的解释N2O对木纳格葡萄果实腐烂率的抑制作用。

3 结论

在(0±0.5) ℃的温度条件下，采用N2O处理对木纳格葡萄进行间歇熏蒸，能显著保持可溶性固形物、可滴定酸的含量；有效的抑制腐烂率、落粒率及相对电导率的上升，从而较好的保持了硬度；同时也抑制了POD和APX的活性，其中50 μL/L N2O处理组效果优于其他处理组。说明N2O间歇熏蒸能够延缓果实的衰老，较好地维持木纳格葡萄的贮藏品质。

[1]依马木,王莉.木纳格葡萄品种简介[J].现代园艺,2003, 4:21-22 YI Ma-mu, WANG Li. Munage Grape varieties introduction[J]. Modern Gardening, 2003, 4: 21-22

[2]Champa W A H, Gill M I S, Mahajan B V C, et al.Postharvest treatment of polyamines maintains quality and extends shelf-life of table grapes (Vitis viniferaL.) cv. Flame Seedless [J]. Postharvest Biology & Technology, 2014, 91(5):57-63

[3]Benkeblia N, Varoquaux P. Effect of nitrous oxide (N2O) on respiration rate, soluble sugars and quality attributes of onion bulbsAllium cepa, cv. Rouge Amposta during storage [J].Postharvest Biology & Technology, 2003, 30(2): 161-168

[4]Leshem Y Y, Wills R B H. Harnessing senescence delaying gases nitric oxide and nitrous oxide: a novel approach to postharvest control of fresh horticultural produce [J].Biologia Plantarum, 1998, 41(1): 1-10

[5]方华军,程淑兰,于贵瑞,等.森林土壤氧化亚氮排放对大气氮沉降增加的响应研究进展[J].土壤学报,2015, 52(2):262-271 FANG Hua-jun, CHENG Shu-lan, YU Gui-rui, et al.Research progress on response of nitrous oxide emission in forest soil to increase of atmospheric nitrogen deposition [J].Acta Soil Science, 2015, 52(2): 262-271

[6]Sowa S, Towill L E. Effects of nitrous oxide on mitochondrial and cell respiration and growth in distichlis spicata,suspension cultures [J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture,1991, 27(2): 197-201

[7]Gouble B, Fath D, Soudain P. Nitrous oxide inhibition of ethylene production in ripening and sensecing climacteric fruits [J]. Postharvest Biology & Technology, 1995, 5(4):311-321

[8]Palomer X, Roig-Villanova I, Grima-Calvo D, et al. Effects of nitrous oxide (N2O) treatment on the postharvest ripening of banana fruit [J]. Postharvest Biology & Technology, 2005,36(2): 167-175

[9]Benkeblia N, Varoquaux P. Effect of nitrous oxide (N2O) on respiration rate, soluble sugars and quality attributes of onion bulbsAllium cepa, cv. Rouge Amposta during storage [J].Postharvest Biology & Technology, 2003, 30(2): 161-168

[10]Qadir A, Hashinaga F. Inhibition of postharvest decay of fruits by nitrous oxide [J]. Postharvest Biology & Technology,2001, 22(3): 279-283

[11]Lichanporn I, Techavuthiporn C. The effects of nitric oxide and nitrous oxide on enzymatic browning in longkong [J].Postharvest Biology & Technology, 2013, 86(86): 62-65

[12]胡江伟.NO处理对伽师瓜采后抗氰呼吸及相关基因AOX的影响[D].乌鲁木齐:新疆农业大学,2015 HU Jiang-wei. Effect of NO treatment on postharvest cyanobacterial respiration and related gene AOX in Jiashi melon [D]. Urumqi: Xinjiang Agricultural University, 2015

[13]敬媛媛,吴斌,李艳娇,等.一氧化氮处理对甜瓜果实采后病害的控制及活性氧代谢的作用[J].现代食品科技,2016,12:186-190 JING Yuan-yuan, WU Bin, LI Yan-jiao, et al. Effect of nitric oxide treatment on postharvest disease control and reactive oxygen metabolism in melon [J]. Modern Food Science and Technology, 2016, 12: 186-190

[14]郭芹,王吉德,李雪萍,等.一氧化氮处理对采后番木瓜果实乙烯生物合成的影响[J].广东农业科学,2013,40(3):75-78 GUO Qin, WANG Ji-de, LI Xue-ping, et al. Effects of nitric oxide on ethylene biosynthesis in postharvest papaya [J].Guangdong Agricultural Sciences, 2013, 40(3): 75-78

[15]郭芹,高晶,张玉丽,等.二氧化氯和一氧化氮处理对荔枝采后可溶性糖含量的影响[J].食品工业,2013,8:111-114 GUO Qin, GAO Jing, ZHANG Yu-li, et al. Effects of chlorine dioxide and nitric oxide on postharvest soluble sugar content of litchi [J]. Food Industry, 2013, 8: 111-114

[16]张政,王倩,吴斌,等.一氧化氮间歇熏蒸对木纳格葡萄贮藏品质的影响[J].食品科技,2016,8:28-33 ZHANG Zheng, WANG Qian, WU Bin, et al. Effect of intermittent fumigation of nitric oxide on the storage quality of Morgagrams [J]. Food Science, 2016, 8: 28-33

[17]曹建康,江微波,赵玉梅.果蔬采后生理生化实验指导[M].北京:中国轻工业出版社,2007 CAO Jian-kang, JIANG Wei-bo, ZHAO Yu-mei. Fruit and vegetable post-harvest physiology and biochemistry experimental guidance [M]. Beijing: China Light Industry Press, 2007

[18]孔秋莲,修德仁,胡文玉,等.葡萄贮藏中 SO2伤害与膜脂过氧化的关系[J].果树学报,2008,25(3):322-326 KONG Qiu-lian, XIU De-ren, HU Wen-yu, et al.Relationship between SO2injury and membrane lipid peroxidation in grape [J]. Journal of Fruit Science, 2008,25(3): 322-326

[19]Zapata P J, Martínez-Esplá A, Guillén F, et al. Preharvest application of methyl jasmonate (MeJA) in two plum cultivars. 2. Improvement of fruit quality and antioxidant systems during postharvest storage [J]. Postharvest Biology& Technology, 2014, 98(3): 115-122

[20]Imahori Y, Bai J, Baldwin E. Antioxidative responses of ripe tomato fruit to postharvest chilling and heating treatments [J].Scientia Horticulturae, 2016, 198(75): 398-406

[21]宋开艳,阿米尼古丽·再那吉,冯宏祖,等.南疆葡萄采后致病菌分离鉴定及拮抗菌的筛选[J].新疆农业学,2011,48(5):871-876 SONG Kai-yan, Aminiguli·ZaiNaJi, FENG Hong-zu, et al.Sanjiang grapes post-harvest pathogenic bacteria isolation and identification of antagonistic bacteria [J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2011, 48(5): 871-876

[22]Enfors S O, Molin G. Effect of chemically inert gases on the germination of Bacillus cereus spores [J]. Spore Research,1976, 1: 793 -809

[23]段学武,蒋跃明,李月标,等.一氧化二氮处理提高香蕉保鲜效果[J].食品科学,2003,24(4):152-154 DUAN Xue-wu, JIANG Yue-ming, LI Yue-biao, et al.Nitrous oxide treatment improves the preservation of banana[J]. Food Science, 2003, 24(4): 152-154

[24]Chervin C, Thibaud M C. Inhibition of plant and animal cytochrome oxidases by nitrous oxide as a function of cytochrome c concentration [J]. Biochimie, 1992, 74(12):1125-1127

[25]Rocculi P, Romani S, Rosa M D. Effect of MAP with argon and nitrous oxide on quality maintenance of minimally processed kiwifruit [J]. Postharvest Biology and Technology,2005, 35(3): 319-328

[26]王霄倩,王俊芳,刘孝勇,等.不同保鲜处理对红地球葡萄低温贮藏效果的影响[J].食品工业,2016,12:98-102 WANG Xiao-qian, WANG Jun-fang, LIU Xiao-yong, et al.Effects of different preservation treatments on the storage of Red Globe grape at low temperature [J]. Food Industry, 2016,12: 98-102

[27]Liszkay A, Zalm E V D, Schopfer P. Production of reactive oxygen intermediates O2.-, H2O2, and ·OH by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth [J]. Plant Physiology, 2004, 136(2): 3114-3123

[28]Asada K. Ascorbate peroxidase a hydrogen peroxide scavenging enzyme in plants [J]. Physiologia Plantarum,1992, 85(2): 235-241

[29]赵强,张平,朱志强,等.不同品种无核葡萄采后活性氧代谢的比较研究[J].北方园艺,2013,17:20-22 ZHAO Qiang, ZHANG Ping, ZHU Zhi-qiang, et al.Comparative study on postharvest active oxygen metabolism of different varieties of seedless grape [J]. Northern Gardening, 2013, 17: 20-22

[30]程琳琳.NO和 N2O对香蕉采后冷害及香气成分影响[D].乌鲁木齐:新疆大学,2012 CHENG Lin-lin. Effect of NO and N2O on postharvest chilling injury and aroma components of banana [D]. Urumqi:Xinjiang University, 2012

[31]田世平,罗云波,王贵禧.园艺产品采后生物学基础[M].北京:科学出版社,2011 TIAN Shi-ping, LUO Yun-bo, WANG Gui-xi. Horticultural products post-harvest biology [M]. Beijing: Science Press,2011

[32]Vellosillo T, Vicente J, Kulasekaran S, et al. Emerging complexity in reactive oxygen species production and signaling during the response of plants to pathogens [J]. Plant Physiology, 2010, 154(2): 444