竹豆清蛋白的营养价值及基本理化性质

姚海霞，齐斌，黄友如，王立梅

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）（2.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

竹豆（bamboo bean）又名爬豆、饭豆和蔓豆等，属豆科类草本植物，豇豆属，生长在低海拔高温高湿的热带和亚热带地区，我国主要分布在云南、山西、贵州和陕西等地区。与绿豆、小豆相比，竹豆具有抗虫害、耐酸铝、产量高、适应力强等优势[1]，适合在干旱、高温、土壤贫瘠地区种植。竹豆富含淀粉、蛋白质、钙、磷、铁及粗纤维、维A原、维生素B1、维生素B2和维C等[2]。竹豆的营养质量比许多其他豇豆属类高，主要是由于蛋白质和必需氨基酸含量高，且抗营养物质如植酸磷，多酚水平、皂苷和胰蛋白酶抑制剂在竹豆中也相对低于其他豆类食物[3]。竹豆不仅营养丰富，而且还具有“利水、除湿和排血脓，消肿解毒”的功效，对治疗水肿、脚气、黄疸、便血和痈肿等病有明显作用[4]。竹豆还具有抗氧化力和抗糖尿病潜力，它对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，可以抑制晚期糖基化终产物的形成，在食品保健与医药领域具有广阔的应用前景[5]。

然而，竹豆作为一种夏季高产绿肥，其副产物竹豆籽粒一直被用作饲料，造成植物蛋白资源的巨大浪费。目前，国内外对竹豆的农艺性状[6]、栽培措施[7]和种质资源多样性[8]等均有报道，但关于竹豆蛋白的研究报道几乎没有。同时，植物清蛋白的研究大多集中在芸豆[9]、绿豆[10]、米糠[11]和菜籽粕[12]等农作物，围绕提取工艺、功能性质研究展开，关于清蛋白的性质及二级结构研究甚少，因此充分了解竹豆清蛋白的性质及结构，对其在食品中的开发应用具有重要意义。

本文通过阐明竹豆清蛋白的氨基酸组成、亚基分子量分布情况，研究不同pH下的热学性质，采用傅里叶红外对其二级结构进行表征，为竹豆清蛋白的功能特性研究及其应用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

竹豆：购于云南昆明兰姐特产店；聚丙烯酰胺凝胶快速配制试剂盒：碧云天生物技术研究所；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

磁力加热搅拌器：苏州赛恩斯 IKA仪器有限公司；高速冷冻离心机：CR22GⅡ，日本HITACHI公司；紫外可见分光光度计：UVmini-1240，日本SHIMADZU公司；冷冻干燥机：Alpha 1-2 LD plus，德国CHRIST公司；pH计：Seven Easy S20K，瑞士METTLER TOLEDO 公司；分析天平：XS105DualRange，瑞士METTLER TOLEDO公司；电泳仪：Mini-PROTEAN Tetra，美国Bio-Rad伯乐公司；综合热分析仪：TAQ2000，美国TA公司；傅里叶红外光谱仪：NICOLET IS10，美国热电Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 竹豆清蛋白的制备

根据Osborne分级提取工艺[13]，取100 g脱脂竹豆于2 L烧杯中，按料液比1:10加入600 mL去离子水，置于恒温磁力加热搅拌器中，45 ℃搅拌浸提1 h，离心（10000 r/min、4 ℃、20 min）取上清液，沉淀再按料液比1:10重复浸提1次，合并两次上清液。用1 mol/L HCl将其pH调至等电点4.0处，静置30 min离心（10000 r/min、4 ℃、20 min），所得沉淀用适量去离子水溶解，用1 mol/L NaOH回调pH至7.0，4 ℃下透析48 h，冷冻干燥后得竹豆清蛋白。每组实验重复三次，结果取平均值，采用凯氏定氮法测得竹豆清蛋白的纯度为88.75%（干基）。

1.2.2 竹豆清蛋白的氨基酸组成

采用酸水解法测17种氨基酸，步骤如下：准确称取100 mg的样品（精确到0.0001 g），置于水解管中，加8 mL的6.0 mol/L盐酸。充氮气3 min后旋紧胶塞。将水解管封口于120 ℃烘箱中水解22 h，再加4.8 mL 10M NaOH中和，用蒸馏水定容至50 mL。过滤后离心（10000 r/min、4 ℃、15 min），取上清测样。采用碱水解法测色氨酸，称取相同重量样品，加 8 mL 5 mol/L NaOH水解，再加6.7 mL 6 mol/L HCL中和，其他步骤同上。

色谱条件：Agilent Hypersil ODS柱（5 μm，4.0 mm×250 mm）；流动相A：27.6 mmol/L醋酸钠-三乙胺-四氢呋喃体积比为（500:0.11:2.5），流动相B：80.9 mmol/L醋酸钠-甲醇-乙腈体积比为（1:2:2）；流速为1 mL/min；柱温：40 ℃；紫外检测器（VWD）检测波长为338 nm，以外标法进行定量。

1.2.3 竹豆清蛋白的SDS-PAGE电泳

准确称取清蛋白10 mg，溶于2 mL水中，35 ℃下超声提取15 min，离心（4000 r/min，15 min）取上清。取80 μL上清液，加入20 μL上样缓冲液（Sample Loading Buffer×5），再加入2 μL的巯基乙醇，沸水浴下进行5～10 min，使其充分变性。冷却至室温后再离心（12000 r/min，5 min），取10 μL上清液上样。采用晶彩生物的蛋白电泳凝胶制备试剂盒进行制胶，进行不连续垂直电泳，浓缩胶采用60 V、30 min，分离胶采用100 V、1.5 h。待溴酚蓝条带移动到距离分离胶下边缘1 cm左右时关闭电源，结束电泳，凝胶进行考马斯亮蓝G-250染色，脱色后拍照保存。

1.2.4 竹豆清蛋白的热变性

取10 mg左右的竹豆清蛋白，溶于100 μL 0.01 mol/L的不同pH的磷酸缓冲液中，充分混匀。准确称取10 mg左右的样品于铝盘中，密封铝盘，以空铝盘作参比，采用氮气，从30 ℃加热至120 ℃，升温速率为5 ℃/min，试验重复三次。记录曲线峰值点温度，即蛋白变性温度Td，采用仪器自带分析软件计算吸热曲线形成峰的面积，即焓变值ΔH。

1.2.5 竹豆清蛋白的FT-IR测定

采用溴化钾压片法：在暖灯下，取1 mg竹豆清白与100 mg KBr混匀研磨，充分干燥除去水分，均匀压制成片，采用omnic软件进行样品采集。光谱扫描范围为400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1。

图谱处理：取1700～1600 cm-1的酰胺Ⅰ带图谱，用PeakFit v4.12软件进行分析。对曲线依次进行平滑、基线校正、Gaussian去卷积、二阶导数拟合数据处理。

1.3 数据处理

试验结果采用Origin 8.0软件进行数据图像处理，SPSS 20.0软件进行统计和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 竹豆清蛋白的氨基酸组成

表1 竹豆清蛋白的氨基酸组成分析Table 1 Amino acid composition of bamboo bean albumin

由表1可知，竹豆清蛋白氨基酸含量丰富，种类齐全，含有18种人体所需氨基酸及8种人体必需氨基酸，富含谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸，是一种具有开发食用前景的植物蛋白资源。其中，谷氨酸含量最高，占18.35%；天门冬氨酸次之，占11.73%；半胱氨酸的含量最少，仅有0.11%。非极性氨基酸（即缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸和色氨酸）占38.98%；不带电荷的极性氨基酸（即甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺除外）含量占13.90%；带正电荷的极性氨基酸（即赖氨酸、精氨酸和组氨酸）含量占16.93%；带负电荷的极性氨基酸（即天冬氨酸与谷氨酸）含量占30.08%；必需氨基酸（即苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸）含量占39.96%；

而所必需的半必需氨基酸（即精氨酸、组氨酸）含量占9.48%。根据表1数据，能够计算出必需氨基酸/氨基酸总量（E/T）为39.96%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）的值为66.55%。这与FAO/WHO[14]提出的必需氨基酸占总氨基酸的比值为40%、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为60%以上的参考蛋白模式相符，说明竹豆清蛋白属于一种优质的植物蛋白。

2.2 竹豆清蛋白的SDS-PAGE分析

图1 竹豆清蛋白的SDS-PAGE还原电泳Fig.1 SDS-PAGE profile of bamboo bean albumin

竹豆清蛋白的SDS-PAGE电泳图如图1所示，通过Image Lab软件，将蛋白质Marker的分子量对数与条带相对迁移率作标准曲线：y=-2.4*x+2.88，R2=0.9833（y为条带相对迁移率，x为分子量对数）。将竹豆清蛋白条带相对迁移率带入上式，计算其主要亚基分子量。

如表2所示，竹豆清蛋白含有9个亚基条带，分别为113.3 ku、103.5 ku、94.6 ku、49.6 ku、35.3 ku、32.3 ku、27.6 ku、24.0 ku、19.7 ku。其中最主要亚基分布在 49.6 ku和 27.6 ku，分别占总量的 61.1%和20.6%，这与李永武提取的绿豆清蛋白[10]亚基分子量分布相似。

表2 SDS-PAGE竹豆清蛋白分子量分布表Table 2 Molecular weight distribution table of bamboo bean albumin obtained by SDS-PAGE

2.3 竹豆清蛋白的热稳定性分析

蛋白天然结构的改变及变性过程常伴随着焓变，常采用差示热量扫描（DSC）来进行监控。在DSC谱图中，最大峰对应的温度即变性温度（Td），代表蛋白质的热稳定性[15]。由图1和表3可知，竹豆清蛋白的变性温度（Td）从高到低依次对应 pH：7＞5＞9，在pH=7.0时最高，达到100.6 ℃，热稳定性最强。这是因为当pH在5～7时，接近蛋白原生环境，蛋白所带净电荷少，静电排斥力相当低，其天然结构未被破坏，蛋白较稳定。而在pH=9时，大量净电荷诱导，静电排斥力增加，导致蛋白质展开，发生部分变性，热稳定性降低。

图2 pH对竹豆清蛋白热变性的影响Fig.2 Effect of pH on thermal denaturation of bamboo bean albumin

表3 pH对竹豆清蛋白Td和ΔH的影响Table 3 Effect of pH on Td and ΔH of bamboo bean albumin

变性焓(ΔH)即样品发生转变前后吸热峰的峰面积，反映蛋白质分子的疏水性或亲水性，同时也表征蛋白质分子的聚集程度（反应有序结构比例）。它是蛋白质变性过程中热能变化的指标值，主要反映在分子间氢键的断裂和疏水作用，氢键断裂吸热，破坏疏水作用放热[15]。由表3可知，竹豆清蛋白的变性焓(ΔH)从高到低依次对应pH：5＞7＞9，说明变性焓(ΔH)随pH的升高而降低，这与黎卫[16]等对芡实谷蛋白热学性质的研究结果相符。pH=5.0时，变性焓(ΔH)达到最大，为3.40 J/g，表明此时蛋白有序结构比例最高[17]。这归功于在这种pH下，蛋白静电斥力较小，疏水基团埋藏在蛋白质内部，疏水作用较小，蛋白结构紧凑有序，热变性时需吸收更多热能，焓变值较大。而在pH=9.0时，较强的静电斥力使蛋白分子伸展，疏水基团大量暴露，疏水作用增大，蛋白结构从有序向无序结构转变，发生部分变性，热变性吸收的热能减少，焓变值变小。总的来说，竹豆清蛋白在等电点附近及中性环境下，蛋白结构有序紧凑，热稳定性更好，而在碱性条件下，蛋白易发生变性，无序结构增多，热稳定性较差。

2.4 竹豆清蛋白的红外光谱分析

图3 竹豆清蛋白的红外光谱图Fig.3 Infrared spectrogram of bamboo bean albumin

由图3可知，在3414 cm-1有强而宽的吸收峰，可能是蛋白质 N-H的反对称伸缩振动或者是醇羧基的O-H伸缩振动；2961 cm-1处有吸收，是烷烃CH3的反对称伸缩振动。蛋白质的肽链段属于肿酰胺，当蛋白二级结构以α螺旋为主时，C=O伸缩振动频率在1651 cm-1，以β折叠为主时，位于1637 cm-1左右，1641 cm-1处的吸收峰表明固态状态下竹豆清蛋白的有序结构以β折叠为主，这也与红外拟合结果相一致[18]。1543 cm-1处的吸收可能源于 NH4+的不对称变角振动或者肿酰胺Ⅱ的C-N-H弯曲振动；1444 cm-1处的峰形尖而窄，可能是NH3+的对称变角引起的，1401 cm-1的吸收峰可能是氨基酸化合物特征基团COO引起的对称伸缩导致；1239 cm-1处的吸收峰可能是清蛋白C-N的伸缩振动或C=N=N的对称伸缩振动；1076 cm-1的吸收峰可能是竹豆清蛋白中的直链C-C伸缩振动或者杂质糖类C-OH、C-O-C基团的振动引起的。617 cm-1处的吸收峰为杂质峰，可能是磷酸盐或硫酸盐类引起的不对称变角振动。

蛋白质红外光谱图上的特征吸收主要分为三组：1700～1600 cm-1、1580～1500 cm-1以及 1340～1220 cm-1，分别对应的蛋白质的酰胺Ⅰ带（C=O伸缩振动）、酰胺Ⅱ带（C-N伸缩振动和N-H变形）、酰胺Ⅲ带（C-N伸缩振动）。

酰胺Ⅰ带的吸收峰一般能反应蛋白质的二级结构，同时酰胺Ⅰ带的谱峰指认目前已经比较成熟，其对应关系如下：β折叠（1610～1640 cm-1），无规卷曲（1640～1650 cm-1），α螺旋(1650～1658 cm-1)，β转角（1660～1700 cm-1）[19,20]。

本实验采用 KBr压片法，在图谱处理中，采用Savitsk-Golay函数平滑后，进行二阶导数和傅里叶去卷积，采用Gausse函数对谱图进行拟合，多次拟合使残差最小。

图4 竹豆清蛋白酰胺Ⅰ带曲线拟合结果Fig.4 The curve fitting results of amideⅠband from bamboo bean albumin

如图4所示，根据各子峰的积分面积与波谱对应的二级结构关系，计算出二级结构的相对百分含量。

表4 傅里叶红外(FT-IR)下竹豆清蛋白二级结构含量Table 4 Secondary structure content of bamboo bean albumin determined by Fourier transform infrared spectroscopy(FT-IR)

如表4所示，可知竹豆清蛋白中β转角(33.59%)所占比例最高，其次是β折叠(31.38%)，α螺旋(17.97%)和无规卷曲(17.07%)。其中α螺旋、β折叠、β转角占蛋白二级结构的80%以上，无规卷曲结构较少，因此可认为竹豆清蛋白是一个高度有序且稳定的蛋白质[21]。这与莲子清蛋白二级结构含量：β转角36.96%，β折叠33.88%，α螺旋20.39%和无规卷曲结构8.77%相似[22]。通过FT-IR可知，该制备工艺下竹豆清蛋白二级结构以β折叠和β转角为主，具有较少的α螺旋和无规卷曲结构，是一个高度有序且稳定的蛋白质。

3 结论

竹豆清蛋白富含18种氨基酸，且人体必需氨基酸种类齐全、组成平衡，富含谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸，是一种具有开发食用前景的植物蛋白资源。竹豆清蛋白含有9个亚基，分子量分布较广，主要集中在49.6 ku和27.6 ku处。pH对竹豆清蛋白热学性质影响显著，其变性温度（Td）在pH=7.0时最高，可达到100.6 ℃，热稳定最高；变性焓ΔH在pH=5.0时最大，表明此时有序结构比例最高。傅立叶红外结果显示，竹豆清蛋白二级结构以β折叠和β转角为主，具有较少的α螺旋和无规卷曲结构。通过研究竹豆清蛋白的理化性质及二级结构，可为其功能性质的研究与应用开发提供理论依据，对其在食品生产加工、药物生产或其他工业领域的应用具有重要参考价值。

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