OCT-1、ABCB1 mRNA水平对慢性髓细胞性白血病伊马替尼治疗的临床意义

程艳红，江潇潇，徐修才

慢性髓细胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于多能干细胞的髓系增殖性肿瘤，BCR-ABL融合基因是该病的特征性改变，融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性。伊马替尼(imatinib, IM)是一种有效的酪氨酸酶抑制剂，目前作为一线治疗方案,但是临床上有15%的CML患者表现出耐药[1]。尽管临床上最常见的耐药机制是BCR-ABL激酶结构域的突变、异常扩增或过表达。但有研究[2]表明，药物转运蛋白，特别是人类有机阳离子转运蛋白1(human organic cation transporter，OCT-1)和三磷酸腺苷结合盒蛋白B亚家族成员1 (ATP-binding cassette sub-family B member 1，ABCB1)对于酪氨酸激酶在细胞内的浓度以及对于早期耐药具有关键性作用。许多研究[3-4]涉及OCT-1和ABCB1在体外对IM早期耐药过表达，但到目前为止，外源转运蛋白在体内IM耐药中的作用几乎没有研究。

有研究[5-6]证明BCR-ABL激酶的抑制程度与患者服用IM的疗效有关。而进入并且保留在白血病细胞中IM的量影响BCR-ABL激酶抑制的程度。影响细胞内药物浓度的因素有很多，包括吸收、分布、代谢、排泄等。此外，还与泵入或泵出细胞内外的基因(ABCB1和OCT-1)有关。因此，该研究探讨了这两个基因的表达水平与CML患者IM治疗耐药的关系。此外，当细胞内的药物泵出大于泵入时会导致细胞内药物浓度降低以及削弱BCR-ABL激酶的抑制程度。由于在治疗的第1个月的激酶抑制水平预示着患者对IM的反应，推测在IM治疗的第1个月内ABCB1 mRNA水平明显升高的CML患者更有可能发展为IM耐药，从对接受IM治疗的CML患者的疗效进行评估，并将其与后期的治疗疗效相关联。该研究通过监测IM治疗第1个月内的ABCB1 mRNA表达，以此作为评估CML患者最可能发生IM耐药性风险的手段。

1　材料与方法

1.1病例资料选取安徽医科大学附属省立医院血液科2015年6月～2017年6月收治的97例新确诊的慢性期CML患者，所有患者经临床表现、骨髓涂片和活检、BCR-ABL融合基因或Ph染色体诊断确诊。男63例，女34例，年龄9～75岁，中位年龄41岁。随访时间1～24个月，中位随访时间24个月。试验中涉及到的内容均经本院医学伦理学委员会批准，并且与患者签署知情同意书。

1.2治疗方案根据TIDEL II规定[7]，分别在患者接受IM治疗开始前1天以及在接受IM治疗后的30 d采集外周血。分析患者耐药性风险与ABCB1 mRNA表达水平的关系。同时，在治疗的前3个月复查1次骨髓细胞形态学和染色体核型,以及通过RT-PCR检测BCR-ABL1P210转录本表达；3个月以后每3～6个月复查上述指标。

1.3疗效判定标准参照中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2013年版[8])，最佳反应组：治疗后12个月BCR/ABLIS≤0.1%，警告组：12个月BCR/ABLIS0.1%～1%。治疗失败组：12个月BCR/ABLIS>1%。总生存率(overall survival, OS)：从IM治疗开始至死亡或末次随访的时间。

1.4总RNA的提取采集患者骨髓1～2 ml, EDTA抗凝后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用TRIzol提取试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总的RNA。采用分光光度计检测RNA浓度，测得患者吸光度(optical density，OD)值，OD260/OD280在1.8～2.0符合检测要求标准。

1.5实时荧光定量PCR分析PCR反应采用两步法，PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。根据PrimeScript逆转录试剂盒说明书进行总cDNA合成。逆转录反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃ 保温，在Gene Amp PCR System 9700上进行。应用Applied Biosystems7500型荧光定量PCR仪进行PCR反应，扩增条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40个循环。以GAPDH基因作为内参，每个基因做2个复孔，取平均值，通过2-ΔCt表示各基因的mRNA表达水平。具体引物序列见表1。

2　结果

2.1患者的一般情况治疗最佳反应组46例(47.42%)，警告组23例(23.71%)，治疗失败组28例(28.87%)。97例CML患者2年OS为86.96%。见表2。

表1　各引物序列

表2　97例CML患者的临床和分子学反应特征[n(%)]

2.2OCT-1、ABCB1mRNA表达水平与IM治疗CML患者的分子学反应关系根据CML患者的治疗疗效，将患者分为两组，其中警告组(n=23)和治疗失败组(n=28)为一组，最佳反应组(n=46)为另一组。分别对两组的OCT-1、ABCB1 mRNA表达水平进行分析，结果显示最佳反应组患者的OCT-1 mRNA高表达，差异有统计学意义(P<0.01)，而在警告组和治疗失败组中ABCB1 mRNA高表达，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.3BCR/ABL融合基因分子反应水平以及OCT-1、ABCB1mRNA表达水平与总生存率OS之间的关系本研究随访了97例CML患者，随访时间为2年。如图2A所示，2年OS为86.96%。而BCR/ABL融合基因分子反应应答最佳反应组、警告组和治疗失败组的2年OS分别为91.05%、85.91%、80.63%，三组间差异无统计学意义(P=0.487 9)，见图2B；OCT-1 mRNA高表达组(90.41%)与OCT-1 mRNA低表达组(81.87%)的2年OS差异无统计学意义(P=0.280 8)，见图2C；ABCB1 mRNA高表达组(86.70%)与ABCB1 mRNA低表达组(93.13%)的2年OS差异无统计学意义(P=0.349 9)，见图2D。表明IM治疗所获得的分子学反应以及转运蛋白(OCT-1、ABCB1)与2年OS之间无明显联系。

2.4监测CML患者ABCB1mRNA表达水平的倍数变化对IM治疗的反应在本研究中，根据BCR/ABL转录水平对41例CML患者进行分组。通过比较ABCB1 mRNA在诊断第1天与服用IM 30 d后的表达，并将其表示为倍数变化。结果表明，在IM治疗的CML患者中2年未达到最佳反应的患者，其治疗第30天的ABCB1 mRNA的表达显著增加。同时，最佳反应组与未达到最佳反应组(警告组和治疗失败组)的ABCB1 mRNA表达水平的倍数变化差异有统计学意义(P=0.002)，见图3。

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2.5ABCB1mRNA表达量的倍数的增加与BCR/ABLIS水平的关系通过比较ABCB1 mRNA高表达组与低表达组的BCR/ABLIS的百分比，结果显示在第1天(P=0.423)或第30天(P=0.160)，BCR/ABLIS百分比差异无统计学意义。见图4。

图1　CML患者IM治疗疗效与OCT-1、ABCB1 mRNA表达水平的关系

图2　CML患者的2年OS

A：采用Kaplan-Meier法估计97例CML患者的2年OS；B：根据BCR/ABL转录水平分析97例CML患者的2年OS(最佳反应组、警告组、治疗失败组)； C：分析91例OCT-1 mRNA高表达(n=43)和低表达(n=48)的CML患者2年OS；D：分析93例ABCB1 mRNA高表达(n=49)和低表达(n=44)的CML患者的2年OS

图3　ABCB1 mRNA表达量的增加对IM治疗疗效的影响

A:最佳反应组(n=20)；B：警告组和治疗失败组(n=21)；与警告组和治疗失败组比较：**P<0.01

图4　BCR-ABL1IS百分比与ABCB1 mRNA表达量间的关系

3　讨论

IM作为一种有效的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂，已被广泛应用于慢性骨髓性白血病的治疗[9]。但随着临床应用范围扩大和时间推移，耐药现象逐渐显现，严重影响治疗效果。对IM耐药的机制研究很多，BCR-ABL酪氨酸激酶结构域突变是IM耐药的主要机制，其他非依赖BCR-ABL的机制尚不清楚。但是关于IM耐药的机制与药物转运蛋白有关的研究逐渐成为热点。

转运蛋白OCT-1能够诱导IM流入细胞。而ABCB1是三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运蛋白超家族的成员之一，ABCB1基因的超表达与临床很多肿瘤药物耐药有关[10]。IM是ABCB1的底物，能被ABCB1泵出，被OCT-1泵入。因此，泵出基因ABCB1和泵入基因OCT-1的差异可能是细胞内IM药物浓度的重要决定因素，也是影响耐药因素之一。

在一些临床研究中，OCT-1 mRNA的表达水平在患者分子反应水平和总体生存率方面与IM治疗效果相关[11-12]。尽管进行了许多研究，但对于泵入和泵出对IM疗效的作用尚未达成一致。早期的研究[13]表明，与最佳反应者相比，12个月时ABCB1 mRNA表达与无反应者或反应不佳或进展为爆发性危机的患者相比，差异无统计学意义。相反，本文提供的数据在治疗开始后不久以及延长治疗后检查ABCB1 mRNA表达，并将其与患者实现主要分子学反应的能力相关联。在本研究中，根据BCR-ABL融合基因表达水平将CML患者分成两组，通过检测OCT-1和ABCB1的mRNA表达水平，显示相对于警告组和治疗失败组，最佳反应组CML患者的OCT-1 mRNA表达水平明显升高。相反，ABCB1 mRNA的表达水平却明显降低。警告组和治疗失败组伴有OCT-1低表达和ABCB1高表达，说明药物转运蛋白是IM治疗的重要因素。

进一步分析CML患者的2年OS，以及治疗疗效、OCT-1和ABCB1 mRNA的表达水平对OS的影响。结果表明最佳反应组、警告组以及治疗失败组间的2年OS差异无统计学意义，同时OCT-1 mRNA高表达组和低表达组、ABCB1 mRNA高表达组和低表达组的2年OS差异也无统计学意义。由此可以推断，除BCR-ABL转录水平之外，还存在其他预测OS的重要因素。

除此之外，为了探讨ABCB1 mRNA表达水平对CML患者发展为耐药性是否具有预测作用，分别监测了CML患者初诊第1天和IM治疗30 d的ABCB1 mRNA表达量，结果显示ABCB1 mRNA表达发生变化，鉴于倍数变化测量两个时间点之间的表达差异。结果表明相对于最佳反应组，警告组和治疗失败组的ABCB1 mRNA表达水平在伊马替尼治疗第30天明显升高，差异有统计学意义。因此，当白血病患者负担仍然明显时(例如，第30天)，治疗一段时间后ABCB1 mRNA表达量的测定可更好地反映白血病人群中ABCB1 mRNA的相对水平。在未能实现主要分子学反应以及进展和(或)发展突变的患者中，ABCB1 mRNA表达增加，并且在治疗早期阶段监测ABCB1 mRNA水平可以作为一种重要预测治疗反应的生物标志物。此外，在治疗早期BCR/ABLIS百分比是CML患者长期治疗反应的预测指标[14-15]，因此，为了研究在治疗第1个月内ABCB1 mRNA表达水平与BCR/ABLIS百分比是否相关，本研究比较了BCR/ABLIS百分比在两组之间的差异(ABCB1 mRNA的高表达与低表达组)。在第1天或第30天，BCR/ABLIS百分比差异均无统计学意义。总之，这些结果表明，IM治疗初诊第1天和第30天之间ABCB1 mRNA表达的倍数变化为确定可能对IM反应不良或反应不佳的患者提供了一种新的预后生物标志物。尽管如此，关于影响ABCB1 mRNA表达量升高的生物学因素尚未清楚，有待进一步地探讨。