复合神经营养因子—3的静电纺丝高分子材料促进兔骨髓间充质干细胞增殖与分化

张善强 李永涛 包鑫 李宇 姚立杰 邓凤春 金海峰 沈雷

[摘要] 目的 探讨以静电纺丝技术制备的聚乳酸-羟基乙酸共聚物/-磷酸三钙 （PLGA/-TCP）高分子材料与兔骨髓间充质干细胞（rBMSC）的生物相容性，并研究rBMSC在复合神经营养因子-3（NT-3）的PLGA/-TCP支架材料上的增殖与分化情况。 方法 选取齐齐哈尔医学院解剖学研究室于2016年7月购买的兔骨髓间充质干细胞。在正常条件下，单独培养的rBMSC为对照组；将rBMSC种植在PLGA/-TCP支架材料上为PT组；以100 ng/mL重组NT-3蛋白刺激的PT组为NT-3/PT组，各组均行成骨诱导实验21 d。利用CCK-8实验于成骨诱导第2、7、14、21天检测各组rBMSC增殖情况；ELISA实验检测各组rBMSC的碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白-1（BMP-1）及核心结合因子a-1（Cbfa-1）等蛋白含量。结果 相对于PT组，NT-3/PT组的细胞增殖OD值在2 d（0.392±0.027）、7 d（0.594±0.024）、14 d（0.978±0.089）、21 d（1.124±0.045）均明显增高，差异有统计学意义（P<0.01）； NT-3/PT组的ALP、BMP-1及Cbfa-1等蛋白含量[（1.525±0.352），（1.678±0.102），（1.104±0.076）pg/mL]均高于PT組[（1.154±0.741），（1.321±0.131），（0.852±0.067）pg/mL]，差异有统计学意义（P<0.01）。结论 复合NT-3的PLGA/-TCP静电纺丝高分子材料有效促进MSC增殖和向成骨细胞分化。

[关键词] 神经营养因子-3；聚乳酸-羟基乙酸共聚物；-磷酸三钙；骨髓间充质干细胞；静电纺丝

[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）02（a）-0009-05

Electrospinning of Compound Neurotrophic Factor-3 Promotes Proliferation and Differentiation of Rabbit Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

ZHANG Shan-qiang1， LI Yong-tao1， BAO Xin2， LI Yu1， YAO Li-jie1， DENG Feng-chun1， JIN Hai-feng1， SHEN Lei1

1.Department of Anatomy， Basic Medical Institute of Qiqihar Medical College， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China； 2.Information Reference Department， Qiqihar University Library， Qiqihar， Heilongjiang Province， 161006 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the biocompatibility of poly （DL-lactic-co-glycolic acid） / tricalcium phosphate （TCP-TCP） prepared by electrospinning with rabbit bone marrow mesenchymal stem cells （rBMSC） Proliferation and Differentiation on PLGA / -TCP Scaffolds with Nerve Trophoblast-3 （NT-3）. Methods Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells purchased by anatomical research laboratory of Qiqihar medical college in July 2016 were selected. Under the normal situation， the rBMSC cultured alone as control group； the rBMSC implanted into the PLGA/-TCP polymeric material as PT group； the PT group stimulated by 100 ng/mL NT-3 recombination protein as NT-3/PT group， each group was subjected to osteogenic induction for 21 days. The CCK-8 assay was used to detect the proliferation of rBMSC on 2， 7， 14 and 21 d of osteogenic induction experiment in each group； ELISA experiment was used to detect the contents of alkaline phosphatase （ALP）， bone morphogenetic protein-1（BMP-1）， and core binding factor a 1（Cbfa-1） in each group. Results Compared with PT group， the cell proliferation OD values of NT-3/PT group were significantly elevated in 2 d（0.392±0.027）， 7 d （0.594±0.024）， 14 d （0.978±0.089）， 21 d （1.124±0.045）， the difference was statistically significant（P<0.01）； the contents of ALP， BMP-1 and Cbfa-1 protein in NT-3/PT group [（1.525±0.352），（1.678±0.102；），（1.104±0.076）pg/mL] were higher than those in PT group [（1.154±0.741），（1.321±0.131），（0.852±0.067）pg/mL]， and the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion The electrospun polymeric material combined with neurotrophin-3 effectively promote rBMSC proliferation and osteogenic differentiation.

[Key words] Neurotrophin-3（NT-3）； Poly lactic-co-glycolic-acid copolymer （PLGA）； -Tricalcium phosphate （-TCP）； Bone marrow mesenchymal stem cell （BMSC）； Electrospinning

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cell， BMSC）是来源于中胚层的多能干细胞，具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控和自我复制等特点，是目前骨组织工程治疗骨缺损疾病的理想种子细胞[1]。研究发现，生物活性因子对细胞的生长与分化功能影响显著，在前期的研究中发现神经营养因子-3（Neurotrophin-3， NT-3）可有效促进MSC增殖与成骨分化，并刺激MSC分泌VEGF、bFGF等因子加速局部组织血管的重建[2]。但是，在治疗大面积骨缺损时，还需要有适宜的载体为细胞生长、增殖和分化提供稳定的环境，同时利用支架材料的可降解性与缓释作用，使外源性因子在较长时间内持续发挥作用[3]。研究证实，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid copolymer， PLGA）具有良好的降解性与生物相容性，已被广泛应用于组织工程支架材料。但此类聚合物存在亲水性差、细胞吸附性能低、降解产生有机酸和引起无菌性炎症反应等缺点[4]。-磷酸三钙（-tricalcium phosphate， -TCP）植入机体后反应温和，基本不放热，降解后被生物体迅速吸收和取代，可弥补PLGA的不足[5]。因此，通过合适的方法把两种或多种材料复合是弥补单一材料作为细胞载体不足的有效措施。该次已利用静电纺丝技术成功制备出PLGA/-TCP支架材料[6]。该实验拟在体外将rBMSC接种于具有缓释NT-3作用的复合材料，通过21 d成骨诱导实验研究细胞的增殖和成骨活性，为组织工程修复骨损伤提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

兔骨髓间充质干细胞（RBXMX-90011）、胰蛋白酶-EDTA（TEDTA-10001）、磷酸盐缓冲液（PBS-10001）。α-MEM培养基（SH30265.01B）、胎牛血清（FBS）（SH300 71.03）、青霉素（K0035）、链霉素（K0035）。六氟异丙醇（HFIP）（YBH107501）、PLGA（430471）和-TCP（RC024 70A）。地塞米松（50-02-2）、L-抗坏血酸（PV0001）、-甘油磷酸钠（50020）、L-谷氨酰胺（G8540-100G）。CCK-8细胞增殖检测试剂盒（CK04）。神经营养因子-3（NT-3）重组蛋白（P20783）。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）（PRD1061）、骨形态发生蛋白-1（Bone morphogenetic protein-1， BMP-1）（E-EL-RB0531）、核心结合因子a 1（core binding factor a 1， Cbfa-1）（E-EL-RB15 41c）的酶联免疫吸附试验试剂盒（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）。Emax 酶标仪，SS-2535DC静电纺丝机。

1.2 方法

1.2.1 PLGA/-TCP支架材料 HFIP溶解80% PLGA和20%TCP，制备了重量比为5 %的PLGA/-TCP聚合物溶液。聚合物静电纺丝工艺参数为电场强度21 kV，喷丝孔直径为0.4 mm，电极间距为10 cm，纺丝速度为0.4 mL/h。制备支架厚度为0.9～1.1 mm。静电纺丝高分子材料反复浸泡在含双抗的0.01 mmol/L PBS溶液中。

1.2.2 细胞培养与实验分组 rBMSC以含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、1 μmol/L青霉素和100 U/mL链霉素的α-MEM基本培养基培养。若α-MEM基本培养基含100 μmmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗坏血酸C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠则为成骨诱导培养基。

5×104/mL rBMSC接种于PLGA/-TCP静电纺丝材料上，加入成骨诱导培养基，设为PT组；在PT组基础上，以100 ng/mL兔NT-3重组蛋白刺激的为NT-3/PT组；单独培养的rBMSC为对照組。各组均行成骨诱导实验21 d，每2 d换液1次。

1.2.3 CCK-8实验检测各组细胞增殖 按照实验分组情况，将PLGA/-TCP静电纺丝材料置于培养板内，将1×104 rBMSC接种于材料上。对照组按1×104/孔接种于96孔板中，然后加入成骨诱导培养基，37 ℃，5%CO2培养。分别于实验第2、7、14、21天弃掉原培养基，加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，使用Emax酶标仪在450 nm波长检测各组样品吸光度值（OD值）。

1.2.4 ELISA实验检测各组相关蛋白浓度 2×105成骨诱导21 d的各组细胞，以含1%FBS的α-MEM培养基在37℃，5%CO2条件下培养12 h，收集各实验组上清液，使用ELISA试剂盒检测各组细胞中ALP、BMP-1及Cbfa-1蛋白含量，实验程序按说明书执行。

1.3 统计方法

所有实验均至少重复3次，使用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析， 计量资料结果以均数±标准差（x±s）表示，进行t检验，多组间数据比较用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组rBMSC增殖结果

对各组细胞增殖OD值行方差分析，NT-3/PT组的细胞增殖OD值最明显，与PT组相比，NT-3/PT组的细胞增殖OD值在实验第2、7、14、21天逐渐增高，两者相比差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

2.2 各组rBMSC的ALP、BMP-1、Cbfa-1蛋白含量

通过方差分析各组ALP、BMP-1、Cbfa-1蛋白含量，相对于PT组，NT-3/PT组的ALP、BMP-1、Cbfa-1蛋白含量均明显增高，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）

3 讨论

目前，应用组织工程技术修复骨缺损主要依赖3个关键因素，即血管源性细胞、外源性生长因子和支架材料。来源于骨髓的MSC是最早被发现的多能干细胞，可在体内或体外特定环境下诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种组織细胞，并因具有造血支持和自我增殖等特点，已成为组织工程修复组织器官损伤的首先种子细胞[7]。在骨缺损的修复过程中，损伤区域的血液循环是促进治疗效果的关键因素。血管化的建立不仅可以为植入的细胞和周围组织提供充足的氧分与营养，还可减轻植入材料时产生的炎症反应。但是，单纯地移植MSC或使用骨诱导性材料并不能在短期内诱导血管发生，如果血管形成不足，局部受损组织缺乏营养，就会导致MSC分化不一致甚至导致细胞凋亡[8]。

近来，有研究发现神经与血管的发生发育密不可分，神经营养因子在调控血管生长方面发挥重要作用。NT-3是神经营养因子家族的重要成员，在前期实验中，发现NT-3可有效促进MSC增殖，并通过MSC旁分泌作用，增强VEGF、bFGF等血管再生因子的表达，招募血管内皮细胞归巢，加速糖尿病性皮肤溃疡的修复[2]。但是，生物活性因子在体内半衰期短，易被体液稀释，难以保持局部的有效治疗浓度。因此，开发具有降解性和缓释作用的支架材料就成为促进MSC疗法和发挥生物活性因子持续作用的热点研究。

PLGA因具有良好的降解性与生物相容性，已被组织工程广泛应用于支架材料、药物缓释载体等方面。研究发现，复合MSC的PLGA支架材料虽具备一定的骨修复作用，但该类材料表面缺乏细胞识别信号，很难与细胞发生相互作用[9]。与PLGA相比，-TCP具有更高的骨诱导性和降解率，其独特的晶形结构在局部降解时可产生高浓度的钙、磷等离子，易于在人工骨中形成类骨磷灰石[10]。因此，通过对材料的优化与整合，制备了PLGA/-TCP支架材料。

在该实验中，将rBMSC植入PLGA/-TCP，并在成骨诱导实验第2、7、14、21天分别检测了各组rBMSC的增殖情况，结果显示PT组的细胞增殖OD值[（0.352±0.035），（0.514±0.057），（0.893±0.027），（0.953±0.075）]与对照组[（0.341±0.034），（0.423±0.011），（0.752±0.054），（0.852±0.049）]比较，差异无统计学意义，说明PLGA/-TCP与rBMSC具有良好的生物相容性。杨文峰[11]等人的研究也发现，利用静电纺丝制备的PLGA支架材料的纤维直径（470～620 nm）与天然细胞外基质纤维直径（50～500 nm）十分相近，具有适合细胞生存及增殖的环境。NT-3/PT组的细胞增殖OD值在实验2 d（0.392±0.027）、7 d（0.594±0.024）、14 d（0.978±0.089）、21 d（1.124±0.045）稳定持续增加，并明显高于PT组，说明PLGA/-TCP对NT-3具有良好的缓释调控作用。ALP、BMP-1、Cbfa-1等是检测MSC向成骨细胞分化的重要指标，该次的实验发现PT组和对照组的ALP、BMP-1、Cbfa-1[PT组：（1.154±0.741），（1.321±0.131），（0.852±0.067）pg/mL；对照组：（0.764±0.542），（0.852±0.461），（0.686±0.045）pg/mL]等蛋白表达均无明显差异，证明PLGA/-TCP具有良好的骨诱导性[9-10]。NT-3/PT组ALP、BMP-1、Cbfa-1等蛋白含量[（1.525±0.352），（1.678±0.102），（1.104±0.076）pg/mL]明显高于PT组，说明PLGA/-TCP复合NT-3能加快rBMSC向成骨细胞分化，理论上达到可缩短骨修复过程的指标。

综上所述，利用体外实验观察NT-3与PLGA/-TCP对rBMSC的生长和分化的影响。证明复合NT-3的PLGA/-TCP具备较高的生物相容性，并可有效促进MSC增殖与分化。下一步，可以将携带缓释NT-3的PLGA/-TCP的人工骨质材料植入动物模型中，利用动物体内实验评价生物材料对骨缺损修复的作用及血管形成的影响。

[参考文献]

[1] Turgeman G， Pittman DD， Müller R， et al. Engineered human mesenchymal stem cells： a novel platform for skeletal cell mediated gene therapy[J]. J Gene Med， 2015， 3（3）：240-251.

[2] Shen L， Zeng W， Wu YX， et al. Neurotrophin-3 accelerates wound healing in diabetic mice by promoting a paracrine response in mesenchymal stem cells[J].Cell Transplant， 2013， 22（6）：1011-1021.

[3] Matsiko A， Gleeson JP， O'Brien FJ. Scaffold mean pore size influences mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and matrix deposition[J].Tissue Eng Part A， 2015， 21（3-4）：486-497.

[4] Zhang W， Yang Y， Zhang K， et al. Silk-Poly（lactic-co-glycolic acid） Scaffold/Mesenchymal Stem Cell Composites for Anterior Cruciate Ligament Reconstruction in Rabbits[J]. J Bbiomater Tiss Eng， 2017， 7（7）：571-581.

[5] Khojasteh A， Behnia H， Hosseini FS， et al. The effect of PCL-TCP scaffold loaded with mesenchymal stem cells on vertical bone augmentation in dog mandible： a preliminary report[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater， 2013， 101B（5）：848-854.

[6] Shen L， Zhang P， Zhang S， et al. C-X-C motif chemokine ligand 8 promotes endothelial cell homing via the Akt-signal transducer and activator of transcription pathway to accelerate healing of ischemic and hypoxic skin ulcers[J]. Exp Ther Med， 2017， 13（6）：3021-3031.

[7] Tsai AC， Liu Y， Yuan X， et al. Compaction， Fusion， and Functional Activation of Three-Dimensional Human Mesenchymal Stem Cell Aggregate[J]. Tissue Eng Part A， 2015， 21（9-10）：1705-1719.

[8] Carlier A， Geris L， Gastel NV， et al. Oxygen as a critical determinant of bone fracture healing-A multiscale model[J]. J Theor Biol， 2015， 365：247-264.

[9] Norouzi M， Shabani I， Ahvaz HH， et al. PLGA/gelatin hybrid nanofibrous scaffolds encapsulating EGF for skin regeneration[J]. J Biomed Mater Res A， 2015， 103（7）：2225-2235.

[10] Ogawa K， Miyaji H， Kato A， et al. Periodontal tissue engineering by nano beta-tricalcium phosphate scaffold and fibroblast growth factor-2 in one-wall infrabony defects of dogs[J].J Periodontal Res，2016，51（6）：758-767.

[11] 楊文峰，任远飞，梁武，等.PLGA电纺丝对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J].现代医学，2017（5）：623-627.

（收稿日期：2017-11-07）