SphK1抑制剂二甲基鞘氨醇抑制肺动脉平滑肌细胞增殖及迁移的作用及其可能机制

杨 姣，徐双兰，赵方允，张春芳，张钰旋，刘丽琼，邢西迁，吴绪伟

(1. 昆明医科大学第一附属医院呼吸内一科，云南 昆明 650032；2. 昆明医科大学附属延安医院呼吸内一科，云南 昆明 650051；3. 昆明医科大学附属延安医院药学部，云南 昆明 650051)

低氧性肺动脉高压以肺血管阻力及肺动脉压力增高为特征，是多种慢性心、肺疾病的病理生理过程，其中肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)的过度增殖引起肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄所致的肺动脉压力增高是重要的病理机制[1]。新近研究发现，鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase 1，SphK1)可调控细胞增殖、凋亡、迁移，其已成为治疗肿瘤的新靶点[2]，但目前尚不清楚SphK1是否调控PASMCs的增殖、凋亡和迁移，从而调控肺动脉高压的发生、发展。因此，我们拟应用SphK1的抑制剂二甲基鞘氨醇(N,N-dimethylsphingosine，DMS)干预低氧诱导的大鼠PASMCs,观察其对PASMCs增殖、凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与试剂原代培养大鼠PASMCs，具体步骤参见文献[3]。DMS、抗SphK1多克隆抗体、抗RhoA多克隆抗体、抗Rho激酶抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1MTT实验 将细胞分为常氧组、低氧组、低氧+DMS(10 μmol·L-1)组。常氧组置于37℃、5% CO2、21% O2，低氧组置于37℃、5% CO2、1% O2培养箱恒温培养。培养6、24、48、72 h后，按MTT试剂盒说明书检测各组细胞的增殖情况。

1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡 常氧组、低氧组和低氧+DMS(10 μmol·L-1)组细胞培养24 h后，参照细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行操作，以流式细胞仪检测PASMCs的凋亡。

1.2.3划痕法检测细胞迁移 处理各组PASMCs，分别制备成单细胞悬液，以无菌200 μL的移液器吸头划痕，各组PASMCs分别处理24 h后，以倒置相差显微镜观察划痕边缘细胞迁移情况并拍照，以Photoshop软件分析PASMCs迁移程度。

1.2.4Western blot 蛋白免疫印迹分别检测SphK1、RhoA、Rho激酶等蛋白的表达。

2 结果

2.1DMS抑制低氧诱导的PASMCs增殖6 h低氧对PASMCs的增殖无明显促进作用，24 h低氧促进PASMCs细胞的增殖，且至低氧72 h，PASMCs增殖较常氧组更明显(P<0.05)；而以10 μmol·L-1的DMS处理细胞后，6 h后细胞增殖较低氧组差异无显著性，而24、48、72 h细胞增殖较低氧组明显受到抑制，差异有统计学意义(P<0.05)，见Tab 1。

2.2DMS促进PASMCs凋亡流式细胞术检测结果显示，DMS处理低氧诱导的PASMCs后，可明显促进PASMCs凋亡，与低氧组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

Tab 1 The proliferation inhibitory rate of PASMCs treated with n=5)

#P<0.05vsnormoxia;*P<0.05vshypoxia

2.3DMS抑制PASMCs迁移与常氧组相比，1%低氧24 h促进PASMCs迁移(57.3±5.6) μm(P<0.05)。与低氧组相比，低氧+DMS组PASMCs的迁移距离明显减少(28.5±2.6) μm(P<0.05)。

2.4DMS抑制SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白的表达与常氧组比较，低氧组PASMCs SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。在10 μmol·L-1的DMS作用下，PASMCs的SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白表达水平分别下降到低氧组的29%、43%、47%(P<0.01)。

3 讨论

近年来的研究发现，鞘脂可通过调控细胞周期，在调控细胞凋亡等生物学行为中发挥重要作用[4]。SphKl是鞘脂的重要激酶，它可通过调控鞘脂代谢的平衡，促进细胞增殖、迁移[5]。本研究证实，低氧条件下培养的PASMCs中SphKl蛋白表达增加，而SphKl抑制剂DMS抑制低氧诱导的PASMCs增殖和迁移，且诱导其凋亡，并明显抑制SphK1、RhoA、Rho激酶蛋白的表达，提示在低氧性肺动脉高压发生中，DMS可能通过抑制SphK1、RhoA、Rho激酶的表达，发挥抗细胞增殖和迁移的潜能。我们前期研究表明，RhoA/Rho激酶信号通路在低氧性肺动脉高压发生、发展及防治中发挥关键作用，Rho激酶抑制剂可有效降低低氧性肺动脉高压大鼠模型和肺动脉高压患者的肺动脉压力[6]。因此，我们将进一步深入研究DMS通过调控RhoA/Rho激酶信号通路，调节PASMCs增殖、迁移的具体机制，从而为低氧性肺动脉高压的防治提供新的靶点。

(致谢：本实验是在昆明市延安医院中心实验室完成，对实验过程给予指导和帮助的老师和同学表示感谢！)

[1] 盖祥云, 林鹏程, 何彦峰, 等. 低氧性肺动脉高压中低氧性肺血管收缩的作用[J]. 中国药理学通报, 2016,32(6): 768-72.

[1] Ge X Y, Lin P C, He Y F, et al. Effect of hypoxic pulmonary vasoconstriction on hypoxic pulmonary hypertension[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(6): 768-72.

[2] Abramson H N. Kinase inhibitors as potential agents in the treatment of multiple myeloma[J].Oncotarget, 2016,7(49): 81926-68.

[3] 杨 姣, 吴绪伟, 张力燕, 等. 不同低氧时间诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞miR-199a表达的动态变化[J]. 国际呼吸杂志, 2015,35(7): 517-20.

[3] Yang J, Wu X W, Zhang L Y, et al. The expression changes of miR-199a in hypoxic-induced pulmonary artery smooth muscle cells of rat[J].IntJRespir, 2015,35(7): 517-20.

[4] Hatoum D, Haddadi N, Lin Y, et al. Mammalian sphingosine kinase (SphK) isoenzymes and isoform expression: challenges for SphK as an oncotarget[J].Oncotarget, 2017,8(22): 36898-929.

[5] Xing X Q, Li Y L, Zhang Y X, et al. Sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signalling pathway as a potential therapeutic target of pulmonary hypertension[J].IntJClinExpMed, 2015,8(8): 11930-5.

[6] Xing X Q, Gan Y, Wu S J, et al. Rho-kinase as a potential therapeutic target for the treatment of pulmonary hypertension[J].DrugNewsPerspect, 2006,19(9): 517-22.