葛根素与人血浆蛋白结合率研究

刘夏雯

（广州医科大学药学院 广东 广州 511436）

1.前言

葛根素在临床上常用于高血压、冠心病和心血管疾病的治疗。目前对这类异黄酮化合物的临床新应用及新机制探讨是研究热点[1，2]。然而，这类化合物的生物利用度很低。已发现造成低生物利用度的原因包括首过代谢和吸收[3]。然而药物被吸收后，进入血液循环，其中一部分与血浆蛋白结合，另一部分以游离态通过毛细血管壁到达各个靶点，发挥药效。当游离态药物分布至组织或被代谢清除后，部分结合药物又从血浆蛋白重新游离出来。药物与血浆蛋白的可逆性结合对药物的生物利用度发挥了巨大的影响。然而葛根素与血浆蛋白结合率研究尚未报道。

因此，本研究对葛根素与人血浆蛋白结合进行研究。利用平衡透析法对葛根素及人血浆以及人血清白蛋白（HSA）和α1-酸性糖蛋白（AGP）分别进行共孵育。利用液质联用法对透析膜两测的葛根素进行分析。研究葛根素的血浆蛋白结合率，并阐明主要结合的蛋白类型。为理解葛根素的低生物利用度提供依据。

2.实验部分

2.1 材料与试剂

葛根素和鸢尾苷对照品购自美国Sigma公司。人血浆来自于本实验室志愿者。人血清白蛋白和人酸性糖蛋白购于美国Sigma公司。PBS(0.1M，pH 7.4)购自美国GIBCO公司。色谱级甲醇和乙腈购于美国Fisher。其它试剂为化学纯。RED快速平衡透析装置购于美国Thermo。液质联用系统为Agilent1260-6460三重四级杆液质联用系统。

2.2 方法与结果

2.2.1 RED装置预处理 本试验所采用的快速平衡透析装置由便携式的插入管和48孔PTFE基质的底板组成。使用前，底板在20%乙醇溶液中浸泡10min，然后用去离子水冲洗3次后，室温晾干。透析室在去离子水中浸泡10min，重复两次后，在保持膜湿润的条件下立即使用。

2.2.2 样品预处理 内标储备液10μL 20μg/mL置于2mL离心管中，N2吹干后，加入样品100μL，后加入300μL 甲醇，涡旋混合5分钟，13，000×g离心5分钟，取上清，N2吹干，残渣用200μL流动相复溶，2μL进样。

2.2.3 RRLC-MS/MS方法及方法验证

LC-MS/MS方法

分析柱为安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8μm，2.1×50mm）；流动相为0.01% 冰醋酸溶液：甲醇=20%∶80%，流速0.3mL/min。质谱为ESI离子源，正模式。血浆中葛根素含量通过多反应检测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式进行测定。葛根素选择离子对为m/z 417/399，内标鸢尾苷离子对为m/z 463/301。

方法验证

方法验证参考中国药典9012指导原则。主要验证参数为：专属性，回收率，线性，准确度，精密度，携带效应，基质效应及稳定性。

2.2.4 药物与蛋白结合数学模型及数据处理 利用Scatchard方程，以指结合药物浓度CB为X轴，结合和游离药物浓度比值CB/CU为Y轴，由非线性最小二乘法估计得出Y轴上的截距，即nKa，从而得到药物的结合常数。药物与蛋白结合率按B=(1-CU/CB)×100%计算；

2.2.5 葛根素与人血浆蛋白，HAS和AGP结合反应 分别配制HAS和AGP于PBS至终浓度为40mg/mL和1mg/mL，取空白人血浆，加入葛根素使其终浓度为0.2、1、5、10、15mM。取200μL含药血浆加入样品室，取350μL PBS加入缓冲液室，于37℃孵育4h。样品室和缓冲液室分别吸取100μL和250μL，按照“样品预处理”项下方法操作，由LC-MS检测血浆样品药物总浓度(CB)，缓冲液样品Z中游离药物浓度(CU)。

葛根素与人血浆蛋白，HAS和AGP在考察浓度范围内（0.2～15μM）结合率分别高于99%，99%和97%。在低浓度范围呈现浓度依赖性，随着药物浓度的增大，结合率升高，当浓度达到1～5μM后，结合率趋于饱和（见图1）。

图1 人血浆白蛋白和酸性糖蛋白中游离葛根素比例。数据表示为平均值和标准误差，n=3。

葛根素与HAS和AGP结合的拟合曲线说明游离药物浓度和结合药物数值都有良好的相关性，r2(+)=0.9799，r2(-)=0.9847，提示了葛根素与HAS和AGP的结合类型可能均属于一类位点的不饱和结合。结合常数分别为3.5×107M-1和1.5×107M-1。

3.讨论

结果表明高血浆蛋白结合率限制了葛根素进入靶组织，造成其低生物利用度。另外，葛根素与AGP和HSA都高度结合，提示了葛根素与人血浆的高结合率来源于与HSA和AGP的共同作用。

[1]张玲，王洪新，齐志敏，孙媛.葛根素对大鼠心肌肥厚的相关细胞因子的影响[J].中成药，2007，29(7):960-963.

[2] Chengfeng Luo,Mu Yuan,Minsheng Chen.Metabolites of puerarin identified by liquid chromatography tandem mass spectrometry：Similar metabolic profiles in liver and intestine of rats.Jounarl of Chromatography B,2010, 878,363-370.