被动吸烟和饮酒对大鼠肝损伤的实验研究

王凝之 郝建宇

（1扬州大学附属医院消化内科 江苏 扬州 225001）

（2首都医科大学附属北京朝阳医院消化内科 北京 100020）

吸烟是一种呈全世界流行的生活习惯,许多研究表明吸烟是导致呼吸系统、心脑血管系统多种疾病的主要危险因素。近年来也有研究发现吸烟对肝脏功能有所影响。饮酒对肝脏有直接损害。流行病学研究表明，同时吸烟和饮酒会增加肝脏疾病的风险和加重肝脏疾病。

1.实验材料

1.1 主要实验试剂及药物

雄性Wistar大鼠：购于中国人民解放军军事科学院实验动物中心；中南海香烟：购于北京卷烟厂(焦油量14mg，烟气烟碱量1.2mg，烟气一氧化碳量14mg)；牛栏山二锅头56°；七氟烷；10%甲醛；PBS磷酸盐缓冲液：购于北京中杉金桥生物技术有限公司；羟脯氨酸检测试剂盒：购于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要实验仪器

染毒箱；LDZ4-0.8型低速自动平衡微型离心机（中国北京）；Beckman DU-7紫外分光光度计（美国）；MSF-1旋涡混匀器（中国北京）；CF长风电热恒温水浴箱（中国北京）。

2.动物分组、实验方法和标本的获取

2.1 动物分组

采用Wistar雄性大鼠100只，体重200～300g,购自于中国人民解放军军事科学院实验动物中心。在实验室常规饲养，1周后,称重,平均体重为（226.4±14.7）g。随机分为4组：吸烟组（n=30），饮酒组（n=30），both组（n=30），对照组（n=10），共计100只。

2.2 实验方法

A：吸烟组：将大鼠放入80cm×60cm×58cm的有机玻璃制成的染毒箱内，在其右上角开一个直径1cm的通气孔。每次吸烟16支，每次时长70min ，每天2次，中间间隔4h，连续12周。

B：饮酒组：用酒灌胃7g/kg，每日两次，酒精剂量(g)=白酒体积(m1)×白酒体积分数(0.56)×酒精相对密度(0.8g·ml)，连续12周。

C：both组：每日吸烟两次（方法同吸烟组），每日早晚用酒灌胃两次（方法同饮酒组），连续12周。

D：对照组：正常饮水、饮食，不作任何处理。

分别在4周、8周、12周将大鼠处死，每个时间点取吸烟组、饮酒组、both组6只大鼠，对照组大鼠于12周与其他组大鼠同时处死。

2.3 标本的留取及处置

实验当天被处死大鼠不再接受试验。各时间点前一晚大鼠禁食不禁水。处死大鼠时，予七氟烷吸入性麻醉，取腹壁正中切口打开腹腔，经腹主动脉取血以备血AST的测定。将肝脏组织充分暴露，用眼科剪摘取部分肝脏右叶组织。其中取约10×5mm大小肝脏组织固定于10%中性福尔马林，以便石蜡包埋。

2.4 统计学的处理

计量资料用X±SD表示，使用SPSS16.0统计软件，数据处理采用方差分析，以P＜0.05为有统计学意义，以P＜0.01为差异有显著性。

3.实验结果

3.1 AST结果

吸烟组、饮酒组、Both组大鼠的血清AST的含量在4周时便出现升高，其中饮酒组大鼠的血清AST的含量在4周时升高幅度明显高于吸烟组、Both组和对照组，其均数比较有明显统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）。在12周时实验组和对照组比较均有明显统计学意义（P＜0.01）。（见表1）

表1 AST(U/L)

3.2 羟脯氨酸含量

吸烟组大鼠的肝组织中的羟脯氨酸含量在12周时与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。饮酒组大鼠的肝组织中的羟脯氨酸含量在12周时与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。Both组大鼠的肝组织中的羟脯氨酸含量在12周时明显高于吸烟组、饮酒组和对照组，其均数之间有统计学差异（P＜0.05，P＜0.05）。（见表2）。

表2 羟脯氨酸（ug/g肝重）

3.3 肝脏组织形态学结果：

取肝脏右叶组织进行HE染色后进行肝脏组织形态学改变的评价。对照组大鼠肝脏病理示肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，具有正常的细胞形态和结构（见图1-1）。吸烟组大鼠肝脏组织于12周时有50%（3/6）的大鼠出现了局部形态学改变。在这3只大鼠中，主要的病理改变为肝细胞水肿，肝窦间隙变小，并有少量慢性炎性细胞如浆细胞、淋巴细胞浸润。（见图1-2）。饮酒组4周、8周的时候无明显病理改变。在12周时有83.3%（5/6）的大鼠于肝腺泡的3区(小叶中央静脉周围)，出现肝细胞肿大，胞质疏松、淡染，有些肝细胞内可见小空泡形成。可见双核肝细胞，并可见较多炎性细胞浸润，但并未出现纤维组织增生等纤维化的病理改变(见图1-3)。Both组大鼠肝脏组织4周、8周时无明显改变。12周时亦可见83.3%（5/6）的大鼠小叶中央静脉周围，出现肝细胞肿大，胞质疏松、淡染，部分肝细胞内可见小空泡形成。可见双核肝细胞，炎性细胞浸润（见图1-4）。

图1 HE染色（从左到右，从上到下分别为）：

4.讨论

许多研究表明吸烟是导致呼吸系统、心脑血管系统多种疾病的主要危险因素。近年来国内外也有相关吸烟对肝脏功能影响的报道。国际癌症研究机构已宣布吸烟是肝癌的一个重要的危险因素。

血清转氨酶是肝细胞损伤的敏感指标[1，2]。本实验研究结果显示被动吸烟后，吸烟组大鼠的血清AST的含量在4周、8周、12周的检测均有所升高，且明显高于对照组（P＜0.01）。病理显示吸烟组大鼠肝脏组织在12周时有50%（3/6）的大鼠出现了病理改变。主要的病理改变为肝细胞水肿，肝窦间隙变小，并有少量慢性炎性细胞如浆细胞、淋巴细胞浸润。提示了吸烟对肝脏的影响。

羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，是胶原代谢的重要产物。Hyp含量的测定已成为衡量机体胶原组织代谢的重要指标，能客观地反映肝纤维化程度[3，4]，其变化情况不能从血液Hyp的含量中得到体现，而肝组织中Hyp含量可反映肝纤维化的程度和演变过程[2，5]。本实验研究结果显示吸烟组、饮酒组、Both组大鼠肝脏组织内的羟脯氨酸含量均随时间的延长呈增高的趋势，在12周时均高于对照组，与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。其中Both组大鼠肝脏组织内羟脯氨酸含量在12周时升高明显高于吸烟组和饮酒组，其均数之间有统计学差异（P＜0.05）。提示了肝脏组织胶原含量的增加。

综上所述，在本实验中发现单纯被动吸烟后4周时检测发现大鼠血清AST的升高，12周时病理可见主要的病理改变为肝细胞水肿，肝窦间隙变小，并有少量慢性炎性细胞如浆细胞、淋巴细胞浸润。提示了吸烟可引起肝脏损伤。而被动吸烟和饮酒12周后大鼠肝脏组织羟脯氨酸含量升高，病理上出现出现肝细胞变性和炎性细胞浸润等慢性炎症表现，因此推测被动吸烟和饮酒可能使导致肝脏组织的慢性炎症改变，最终可能会导致纤维化的发生。

[1] DanilukJ,SzusterCiesielskaA,DrabkoJ,et a1.Serum Cytokine Levels in alcohol-relatedlivercirrhosis.Alcohol 2001;23(1):29-34.

[2] TilgH,JalanR,KaserA,etal.Anti-tumor necrosis factoralpha monoclonal antibody therapy in severe alcoholic hepatitis.JHepatol 2003；38(4)：419-425.

[3] Koda M,Murawaki Y,Hirayama C.Free and small peptidebound hydroxyproline synthesis in rat liver in vitro in CCl4-induced hepatic fibrosis[J].Biochem Biophs Res Commun,1988,151:1128-1135.

[4] Okuno H,Hazama H,Murase T,et al.Drug metabolizing activity in rats with chronic liver injury induced by carbon tetrachloride: Relationship with the content of hydroxyproline in the liver[J].Jpn J Pharmacol,1986,41:363-371.