检测蔬菜水果中甲氰菊酯残留试纸卡的研制

◎ 扶 胜，罗维超，杨 梅，周 艳

（贵州勤邦食品安全科学技术有限公司，贵州 贵阳 550009）

甲氰菊酯是一种拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，具有使用浓度低、安全间隔期短、对人畜低毒性、对环境较为友好的特点[1]。甲氰菊酯属于神经毒剂，使昆虫过度兴奋、麻痹而死亡。该药能快速灭杀多种害虫，效果持续时间长。对害虫和叶螨同时具有良好的防治效果，非常适合在害虫、害螨并发时使用[2]。

由于长期不科学的使用，农产品中甲氰菊酯超标现象时有发生，对生态环境的安全以及农产品的品质造成了很大的影响。近年来，菊酯类农药对哺乳动物存在很大的毒副作用[3]，人如果长期食用残留有菊酯类农药的食物就会造成亚慢性中毒或者慢性中毒。因此，研制一种快速检测甲氰菊酯残留的方法对保障人民身体健康以及维护生态环境是十分必要的。

限于目前的检测条件，对生态环境中甲氰菊酯残留的了解情况并不乐观，而所能达到检测目的所用的检测的条件也较为苛刻。目前，国内甲氰菊酯残留检测的标准分析方法主要有色谱法、免疫分析法和薄层层析法[4]，这些方法对操作分析的人员、各种实验的条件以及实验原料试剂和实验过程要求非常高，它的意义只是存在于实验室少量的研究，而无法满足现场的快速检测的需要。对此也有一些关于胶体金试纸条法的报道，本研究在传统胶体金法的基础上，引入金标技术，使样本中药物与金标抗体反应，以期提高检测灵敏度，建立快速、简便、灵敏的检测方法，对食品中甲氰菊酯残留的快速检测有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲氰菊酯：成都思天德生物科技有限公司；抗体、抗原：贵州勤邦食品安全科学技术有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：西安热默尔生物科技有限公司；甲醇：天津富宇化工；氯金酸（HAu Cl4·4H2O）：百灵威科技有限公司；碳酸钾：艾科试剂；柠檬酸三钠、NaCl：成都麦卡希化工有限公司；玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC膜）、样品垫、PVC底板、吸水垫：上海金标生物科技有限公司。CT 300数控切条机：惠州市惠胜精密工业有限公司；XYZ 3000点膜仪：上海金标生物科技有限公司；JEM-1230透射电子显微镜：深圳市盛光仪器有限公司；CHK-2561B 紫外可见分光光度计：济南鑫贝西生物技术有限公司；TGL-20b R高速冷冻离心机：上海高致精密仪器有限公司；SH-4C磁力搅拌器：巩义予华仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 胶体金的制备及其品质测定

在锥形瓶中，用双蒸水将质量分数为1.2%的氯金酸溶液稀释至0.03%，取100 mL，在沸腾；持续高温、持续搅拌条件下和3 mL 0.5%的柠檬酸三钠溶液制备胶体金，观察溶液颜色变为酒红色时，继续煮沸15 min后停止加热，冷却至室温，用双蒸水定容至100 mL，4 ℃保存。通过电镜观察和紫外扫描，测量其粒径大小和最大吸收波长。

1.2.2 胶体金标记抗体的制备

在100 mL锥形瓶中加入30 mL胶体金溶液，在搅拌条件下，用浓度为0.4 mol/L的K2CO3溶液调节pH值至8.0，缓慢加入150～300μg抗甲氰菊酯单克隆抗体，搅拌5 min，室温静置45 min；加入质量分数为15%的牛血清白蛋白溶液至终质量分数为1%，静置30 min。4 ℃、13 000 r/min离心35 min，弃去上清液，复溶液重悬沉淀，置于4 ℃冰箱中备用。

1.2.3 检测线与质控线的制作

用包被液将甲氰菊酯抗原与羊抗鼠抗抗体分别进行10倍和60倍稀释，然后用划膜仪按1.2μL/cm量划线，37 ℃烘箱中放置2.5 h，备用。

1.2.3 胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装

先用质量分数为0.4%的BSA、0.04 mol/L的PBS（pH7.2）将样品垫浸泡40 s，37 ℃干燥4.5 h。用喷膜仪按5.5μL/cm在玻璃纤维上喷金标抗体，在37 ℃条件下干燥3 h。将甲氰菊酯的包被抗原用0.03 mol/L的PBS（pH7.4）稀释至0.6 mg/mL，再用喷膜仪按2.2 μL/cm喷到NC膜上，即为检测线；在检测线上距离开始端5 mm处按照喷量为2.2 μL/cm喷涂羊抗鼠抗体IgG（0.4 mg/mL），即为质控线，37 ℃干燥条件下2.5 h。将NC膜、玻璃纤维、样品垫和吸水垫依次组装在底板上，切割成4 mm宽的试纸条并装入塑料卡壳中，即为检测卡。

1.2.4 检测方法

将检测卡平放在桌面上，取待检样品50μL缓慢加入检测卡加样孔中，液体开始流动时计时，8 min后观察结果。如果检测线上出现红色条带，说明样品呈阴性；如果检测线上未出现红色条带，说明样品呈阳性；质控线应始终为红色，无质控线说明试纸条失效。

1.2.5 检测限实验

取经检验合格的白菜、苹果，匀质以后各分成8份，每份（2.0±0.05）g，加入甲氰菊酯标准品，使各份白菜、苹果中甲氰菊酯的终质量浓度分别为0、0.5、1、2、4、8、16 μg/kg和32 μg/kg，加入8 mL样本提取液，涡旋仪涡动5 min；4 000 r/min室温离心5 min；取70 μL上清液用检测卡检测，每个浓度样品重复3次，判断试纸条的检测限。

1.2.6 特异性实验

以0.025 mol/L的PBS（pH7.2）为稀释剂，分别配制溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和甲氰菊酯标准品溶液，质量浓度分别为0、1、3、5.0、10.0、20.0 μg/kg和50.0 μg/kg，用检测卡检测，每个浓度重复3次，根据检测结果判断试纸条的特异性。

1.2.7 重复性实验

取3批试纸条分别检测白菜、苹果空白样品和质量浓度为1 μg/kg的阳性样品，每个样品重复5次，判断试纸条的重复性。

1.2.8 稳定性实验

将一定量的检测卡分成3份，分别和干燥剂一起用铝箔袋密闭包装，存放于4、25和30 ℃，每隔1个月取出适量，分别检测白菜、苹果空白样品和质量浓度为1 μg/kg的阳性样品，每个样品重复5次，判断试纸条的稳定性。

1.2.9 方法对比实验

样品检测取不同产地的白菜、苹果样品各7份，每份（2.0±0.05）g，加入8 mL样本提取液，涡旋仪涡动5 min；4 000 r/min室温离心5 min；取70 μL上清液用检测卡检测，每个样品重复5次。同时按GB/T 23502-2009和GB/T 19539-2004和仪器检测方法的结果进行对比。

2 结果与分析

2.1 胶体金的质量分析结果

用紫外可见光分光光度计在400～600 nm波长范围内进行扫描，以双蒸水为空白作对照，测定吸收曲线和吸收峰。结果在波长526 nm处有最大吸收峰，为胶体金的特征吸收峰，如图1所示。胶体金溶液经透射电镜观察结果显示，所制备的胶体金粒径均匀。

图1 胶体金紫外可见光分光光度计扫描图

2.2 试纸条的检测限

对已知空白样品检测时，检测线和质控线颜色深浅几乎相差不大；当甲氰菊酯浓度增加，检测线逐渐减弱，当白菜、苹果中甲氰菊酯浓度增加至1 μg/kg时，检测线较质控线明显减弱；继续增加至10.0 μg/kg和20 μg/kg时，检测线都消失；质控线均出现较深的红色条带。由此可见，该试纸条对蔬菜水果中白菜、苹果的检测限为1μg/kg。国家标注规定甲氰菊酯在农产品中最大限留量为1 mg/kg[5]。

表1 甲氰菊酯快速检测试纸条的检测限表

2.3 试纸条的特异性

由表2可知，甲氰菊酯快速检测试纸条在检测中与其他菊酯无交叉反应，只针对甲氰菊酯有特异结合。

表2 甲氰菊酯快速检测试纸条的特异性表

2.4 试纸条的重复性和稳定性

经验证，甲氰菊酯快速检测试纸条的批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0%。试纸条在4、25、30 ℃的条件下可保存到第12个月，检测空白样品时质控线和检测线的显色仍很清晰，检测白菜、苹果质量浓度1 μg/kg时，质控线与检测线比色较明显；最后确定试纸条密封干燥下，在4～30 ℃的条件下可保存12个月。

2.5 样品检测

通过用试纸条测试18份样品，有1份苹果和2份白菜结果显示阳性，其他样品检测结果均为阴性。用仪器方法检测18份样品，检测结果显示也仅有上述3份样品中甲氰菊酯高于阳性判定线，表明2种方法结 果一致，结果见表3。

表3 GlCA与HPLC和LC-MS/MS检测样品中甲氰菊酯结果的比较表

3 结论

本文采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，通过透射电镜和紫外扫描观察其颗粒大小以保证胶体金的质量，该方法制备的胶体金大小均一，平均直径为20 nm左右。以该胶体金标记甲氰菊酯的单克隆抗体，建立胶体金免疫层析法，对该方法进行优化。实验表明本方法对白菜、苹果等样品检测限为1 μg/kg，批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0，从样本前处理到检测，整个分析流程耗时不到15 min，大大缩短了单个样品的检测时间。与其他方法相比，本法具有快速、简便、灵敏度高、经济适用，样品前处理步骤简单的特点，大大提高了检测效率，十分适合现场大批量样品的现场快速检测。

[1]无锡端.我国茶叶产业发展现状与广东茶叶的未来展望[J].广东茶叶，2011（3）：3-4.

[2]张荷丽，舒友琴.茶叶中农药多残留检测方法概述[J].湖北农业科学，2010，49（2）：476-478.

[3]桌黎阳.茶叶中农药残留分析方法概况[J].中国卫生工程学，2009（2）：36-39.

[4]胡春容，李 君. 拟除虫菊酯农药的毒性研究进展[J].毒理学杂志，2005，19（3）：239-241.

[5]国家卫生和计划生育委员会，中华人民共和国农业部，国家食品药品监督管理总局.GB2763-2016食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量[S].北京：中国标准出版社，2017.