发酵型石榴枸杞酒的工艺优化

李秀秀，吴昊，2，*，白美丹，董晨，李宗磊

（1.徐州工业职业技术学院化学工程技术学院，江苏徐州221140；2.中国矿业大学化学工程学院，江苏徐州 221116）

随着人们物质生活水平的提高，健康成为人们越来越关注的话题，保健酒具有预防疾病，增强人体免疫力等功效，愈来愈受人们的追捧。当前保健酒生产工艺主要有浸泡、勾兑和发酵等方法，其中浸泡、勾兑都不能将原材料中的活性成分充分溶出，因而降低了保健功效，而且酒感差，不易于被消费者接受。

本研究中旨在开发出新型石榴枸杞发酵保健酒，加入的酵母菌能够充分利用果汁中的糖分生成酒精，并将石榴和枸杞中的营养成分溶出，充分汲取了两者的活性有效成分，具有美容养颜、抗衰老、增强人体免疫力，预防心血管及肿瘤等保健功效[1-2]。本文重点探讨了影响石榴枸杞酒的发酵工艺参数，确定最优工艺条件，为石榴枸杞发酵酒的开发和生产提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

石榴：徐州贾汪；枸杞：宁夏；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖：太古糖业有限公司；果胶酶（生化级）：江苏锐阳生物科技有限公司；二氧化硫（食品级）：法国进口；葡萄糖（标准品）：中国计量科学研究院；没食子酸（标准品）、芦丁（标准品）、绿原酸（标准品）：北京万佳首化生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

料理机：九阳股份有限公司；DZG-6090真空电热干燥箱、DK-S24电热恒温水浴锅：上海实验仪器有限公司；WYT-J手持式糖度计：杭州生物科技有限；酒精计：河北省武强县同辉仪表厂；FA1204B电子天平、UV1901PCS紫外可见分光光度计：上海仪器仪表有限公司；SHB循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RV 10旋转蒸发仪：IKA（广州）仪器设备有限公司；GL-20B高速冷冻离心机：上海科学仪器厂；Essentia LC-15C高效液相色谱：SHIMADZU仪器（苏州）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 石榴枸杞酒的工艺流程

1.3.2 石榴汁的制作

挑选个大、无损坏的石榴，去掉外皮和内种皮，用清水清洗数次，按照石榴比水1∶1（g/mL）的比例加水，放入料理机进行榨汁[3]。

1.3.3 枸杞汁的制作

挑选个大、果肉肥厚无霉变的枸杞果，用清水清洗数次，按照枸杞比水2.5∶1（g/mL）的比例加水，浸泡3 h，放入料理机进行榨汁[3]。

1.3.4 成分调配

将两种果汁按照一定比例混合200 mL放入发酵瓶中，用移液管吸取5 mL，在离心机3 600 r/min下离心10min之后，用移液管移取上清液并测量其糖度及酸度，按每17 g/L的糖能产生1%vol酒精调整糖度，本试验用白砂糖调整糖度，使糖度达到25%，用柠檬酸调pH值在3.1～3.8之间即可[4-5]。

1.3.5 混合原料预处理

将成分调配好的果汁混合液，放入一定量的果胶酶和 SO2，接入活化酵母[6-9]。

1.3.6 发酵工艺单因素试验

考察石榴枸杞汁比、酵母量、发酵温度以及发酵时间等4个因素对酒精度的影响，探讨单因素的最佳工艺参数。

1.3.7 发酵工艺正交试验

根据单因素试验，选择了石榴枸杞汁比、酵母量、发酵温度以及发酵时间4个因素3个水平进行正交试验[10-13]。试验因素水平见下表1。

表1 发酵工艺正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process

1.3.8 感官评定

发酵结束，挑选了10名有经验的酿酒师进行品尝，打分取其平均值。石榴枸杞保健酒的感官评定标准包括酒体、口感、色泽3项，总分100分[14-16]。保健酒的评分依据见表2。

表2 酒的感官评定标准Table 2 Sensory organ criteria for evaluation of health wine

1.3.9综合评价

发酵酒的质量主要以酒精度和感官评定为评判标准，因此本试验以酒精度和感官评定各50%的权重为综合评判。综合评价=酒精度×50%+感官评定×50%。

1.3.10 后发酵处理

前发酵结束后，将上部清液转入另一个已灭过菌的发酵瓶中，与酵母及酒脚等沉淀物分离，在16℃～20℃下发酵30 d。

1.3.11 发酵酒多酚类化合物的含量测定

因石榴中含有多种多酚类活性物质，是保健酒中重要的活性成分，因此检测分析发酵酒中的多酚类化合物含量可作为保健酒质量的评判标准。本试验选择没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法进行测定[17-18]。

1.3.12 发酵酒多糖的含量测定

枸杞含有枸杞多糖的活性成分，具有抗氧化作用，增强人体免疫力。因此，对发酵酒中多糖含量的检测和分析，可作为保健酒质量的评价标准。本试验选择以葡萄糖做标准品，用硫酸-苯酚比色法进行测定[19]。

1.3.13 发酵酒黄酮的含量测定

用亚硝酸钠和硝酸铝络合法测定发酵酒中的黄酮含量[20]。

1.3.14 发酵酒绿原酸的含量测定

发酵酒绿原酸含量测定采用高效液相色谱法见文献[21]。

1.3.15 发酵酒质量指标分析

按GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定酒精度、总糖、总酸和干浸出物含量。按GB 2758-2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》测定细菌总数、大肠菌群数以及致病菌数。

2 结果与分析

2.1 石榴枸杞汁比对石榴枸杞发酵酒的影响

取经处理好的石榴枸杞汁，在酵母量4%，发酵温度26℃，发酵时间6 d的条件下，考察不同石榴枸杞汁比对石榴枸杞发酵酒的影响，见图1。

图1 石榴枸杞汁比对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.1 Influence of juice ration on pomegranateandmedlar fermentation wine

由图1可知，当石榴枸杞汁体积比为2∶1时酒精度达到最高，可能是因为此时的石榴枸杞混合汁的渗透压较适合酿酒酵母的生长，因此酵母代谢产生酒精含量高[22]。当逐渐增加石榴汁的比例时，由于石榴汁相比较枸杞汁来说含糖量较低，因此补加的白砂糖愈多，可能对发酵过程产生消极的影响，当二者体积比超过2∶1时酒精度呈下降趋向，这可能与添加白砂糖可能会影响到酵母的正常生长和代谢有关。因此，选择石榴枸杞汁体积比2∶1为最佳汁液比。

2.2 酵母量对石榴枸杞发酵酒的影响

取经处理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁体积比为2∶1，发酵温度26℃，发酵时间6 d的条件下，考察不同酵母量对石榴枸杞发酵酒的影响，见图2。

图2 酵母量对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.2 Influence of yeast addition quantity on pomegranate and medlar fermentation wine

由图2可知，随酵母量的增加酒精度增加，糖度则相应的减少，因为酵母量越多，越有利于糖向酒精产物方向转化，但当酵母量超过3%时，酒精度反而减小，可能是因为酵母量过多，导致微生物繁殖过快而造成底物营养缺乏，微生物产生激烈的竞争，从而影响微生物生长发酵[23]。酵母量超过3%时，由于营养源不足造成发酵酒中的含糖量略微增加，因此选择酵母接种量为3%时为最佳添加量。

2.3 发酵温度对石榴枸杞发酵酒的影响

取经处理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁体积比为2∶1，酵母量4%，发酵时间6 d的条件下，考察不同发酵温度对石榴枸杞发酵酒的影响，见图3。

由图3可知，随着发酵温度的升高酒精度不断增加，当温度到达26℃时酒精度达到最大值，糖度为最小值，温度超过26℃酒精度呈下降趋向，因为温度对酵母菌的生长繁殖有重要的影响，温度低于26℃，此时没有达到酵母菌的最适生长温度，酵母菌生长繁殖较慢，随着温度的升高，酵母菌成长速度逐步加快，26℃时生长繁殖最快，新陈代谢旺盛，产酒精量高。当温度超过26℃时，此时影响了酵母菌的生产繁殖，代谢降低，酒精度降低，所以选择温度26℃为最佳发酵温度。

图3 发酵温度对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.3 Influence of temperature on pomegranate and medlar fermentation wine

2.4 发酵时间对石榴枸杞发酵酒的影响

取经处理好的石榴枸杞汁，在石榴枸杞汁体积比为2∶1，酵母量4%，发酵温度26℃的条件下，考察不同发酵时间对石榴枸杞发酵酒的影响，见图4。

图4 发酵时间对石榴枸杞发酵酒的影响Fig.4 Influence of time on pomegranate and medlar fermentation wine

由图4可知，在发酵3 d～6 d酒精度呈平缓上升，第6天酒精度达到最高，6天之后呈下降趋势，刚开始随着发酵时间不断增加，酵母菌不断适应新的生长环境，经历迟滞生长期，糖醇转化率也在不断提高，第6天的时候酵母菌的发酵趋于稳定，酒精度为最高，随后进入后熟阶段。在后熟阶段，可能有部分糖转变成其他的小分子代谢产物，所以糖含量呈略微下降趋势。选择发酵时间6 d为最佳发酵时间。

2.5 发酵工艺条件优化正交试验

以发酵酒酒精度为考察指标，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。

由表3可知，发酵的最大影响因素是发酵温度，其次依次是酵母量、石榴枸杞汁比、发酵时间。发酵最佳工艺组合为A2B2C3D2，即石榴枸杞汁体积比为2∶1，酵母量为3%，温度为28℃，时间为6 d。

由表4可知，对发酵酒的影响差异极显著的因素是发酵温度（p＜0.01），差异显著的是酵母接种量因素（p＜0.05）。在最佳工艺条件下进行3次验证试验，酒精度为11.5%，评分达到 94.4，见表5。

表3 发酵工艺条件优化的正交试验结果及分析Table 3 Analysis and results of orthogonal experiments for fermentation processes optimization

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance of orthogonal experiments results and analysis

表5 最佳发酵工艺试验结果Table 5 Test results of the optimized fermentation process

2.6 发酵酒活性成分含量检测

在最优工艺条件下获得的发酵酒，经陈酿澄清过滤取样分析，每项测定取3个平行样进行分析检测，结果见表6。

表6 石榴枸杞酒活性成分含量检测结果Table 6 Test results of content of active component on pomegranate and medlar wine

由表6可以看出，发酵酒中含多酚、多糖、黄酮以及绿原酸含量分别为200 mg/L、1.15 g/L、56.14 mg/L、35.15 mg/L，这些有效成分对心血管疾病的防治具有一定的疗效[18]。

2.7 发酵酒的质量指标

2.7.1 理化指标

酒度：11.5%Vol；总糖（葡萄糖计）：17.23 g/L；总酸（柠檬酸计）：5.34 g/L；干浸出物：31.32 g/L。

2.7.2 微生物指标

细菌总数≤50cfu/mL；大肠菌群数≤3MPN/100mL；致病菌数=0。

3 结论

根据单因素试验和正交试验，得出石榴枸杞的最佳发酵工艺条件即石榴枸杞汁体积比为2∶1，酵母量为3%，温度为28℃，时间为6 d，由此得到的保健酒香纯厚，酒味突出，颜色为棕红色，有光泽，透明度高，无苦涩味。发酵酒经过陈酿澄清得到成品酒，经检测，产品符合GB 2758-2012《食品安全国家标准发酵酒及其配制酒》，酒体中含有丰富的活性物质，其中多酚类化合物含量200 mg/L，多糖含量达1.15 g/L，具有防治心血管疾病及增强人体免疫能力等保健功效。

本试验采用石榴枸杞混合发酵酿制保健酒，充分利用了石榴枸杞的营养价值以及保健作用，对今后保健酒的制备有一定的实践指导意义。

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