黄瓜籽总黄酮体外抗氧化作用

冯小雨，郝艳娟，蔡瑜，高江悦，曾桥安，徐斌

（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013）

黄瓜籽又名为哈力苏，是葫芦科植物黄瓜（Cucumis sativus L.）的种子，含有脂肪酸、植物甾醇、黄酮类、挥发油及矿物质等生物活性物质。具有消痰、祛风、补钙等功效[1－2]。黄酮类化合物具有清除人体自由基、抗衰老、抗肿瘤等作用，是应用极为广泛的抗氧化剂，它的药理作用与抗氧化活性之间存在着密切联系[3]。随着黄瓜籽在现代中医药领域的广泛应用，国内外学者对其的化学成分进行了大量的研究，但主要集中在黄瓜籽的游离脂肪酸、挥发油及矿物质元素等方面[4－5]，目前对黄瓜籽黄酮提取及其抗氧化方面的研究较少，本文通过对黄瓜籽黄酮类物质的提取及其体外抗氧化作用的研究，为其进一步的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄瓜籽：吉林市大福源一店；芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl 2-trinitrohydrazine，DPPH）标准品：Sigma公司；抗坏血酸（VC）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝Al（NO3）3、冰乙酸、丙酮、氢氧化钠（NaOH）等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

DK-98-ⅡA恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；BSA124S-CW电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；UV-1750型紫外可见分光光度仪：日本岛津仪器公司；TGL-20M离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；HZL-F100恒温震荡培养箱：太仓市强乐实验设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作

参考陈今朝[6]的方法进行芦丁标准曲线的制备。精确称取0.010 g芦丁标准品，用95%的乙醇溶解并定容至50 mL，保存待用。分别取0.0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5 mL 芦丁标准溶液于试管中，补加95%乙醇至1.5 mL。分别于各试管中加入4%NaNO2溶液0.25 mL，静置反应6min，依次加入10%Al（NO3）3溶液0.25 mL，静置反应6min，最后于各管中加入4%NaOH溶液1.5 mL混匀。在波长510 nm处测得其吸光度值。以芦丁标准溶液的浓度（μg/mL）作为横坐标，吸光度（A）作为纵坐标，绘制出标准曲线。

1.3.2 黄瓜籽中总黄酮的提取

参考于寒松等[7]方法，并稍加修改。称取0.5 g黄瓜籽粉末，同时称取3个平行样置于离心管中，并加入15 mL酸性丙酮溶液（丙酮、蒸馏水与乙酸体积之比为70∶29.5∶0.5）后进行密封。常温300 r/min恒温震荡3 h，对黄瓜籽样品中的成分进行提取。恒温震荡结束以后，将黄瓜籽样品提取液置于暗处12 h。在4 000 r/min条件下离心15min。取其上清液，于4℃冰箱保存，并尽快检测。

1.3.3 样品中总黄酮含量的测定

参考李有宝等[8]方法，并稍加修改。于试管分别加入0.5 mL空白样（95%乙醇）、样品提取液，并补加95%乙醇至1.5 mL。分别向各试管中加入临用现配的4%NaNO2溶液0.25 mL，静置6min后再次分别加入10%Al（NO3）3溶液0.25 mL，静置6min，最后再加入4%NaOH溶液1.5 mL，混匀。于波长510 nm处测其吸光度值。

1.3.4 DPPH自由基清除作用测定

参照王阳等[9]方法进行黄瓜籽DPPH自由基清除作用的测定。各取2 mL不同质量浓度的样品溶液及阳性对照抗坏血酸（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）于试管中，分别加入2 mL0.2 mmol/L的DPPH溶液，振荡混合后，室温避光反应30min，在波长517 nm处测定吸光度值AX；以2 mL无水乙醇代替2 mL DPPH，测定吸光度值Ai；以2 mL蒸馏水代替2 mL样品，测定吸光度值A0。并按照下列公式计算出DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率/%=[A0-（AX-Ai）/A0]×100

1.3.5 羟自由基（·OH）清除作用测定

参考孙涛涛[10]的方法对黄瓜籽进行羟自由基清除作用的测定。各取1 mL不同质量浓度的样品溶液及阳性对照抗坏血酸（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/mL）于试管中，各加入1 mL9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液与1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液，振荡混匀，37℃水浴反应1 h，在波长510 nm处测其吸光度值A1；以蒸馏水1 mL代替H2O21 mL，测定吸光度值A2；以蒸馏水1 mL代替样品1 mL，测定吸光度值A0。按下列公式计算出羟自由基清除率：

羟自由基清除能力/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100

1.3.6 超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用测定

采用苗慧琴[11]的方法进行黄瓜籽超氧阴离子自由基（O2-·）清除作用的测定。取3.2 mL不同质量浓度的样品溶液及阳性对照抗坏血酸（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL），依次加入 4.5 mL 50 mmol/L 的 Tris（三羟甲基氨基甲烷）-HCl缓冲液与0.3 mL 3 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀反应4min，加10 mmol/L的HCl 1 mL终止反应，在波长325 nm处测吸光度值Ax；以3.2 mL蒸馏水代替3.2 mL样品测定吸光度值A0。按下列公式计算出超氧阴离子自由基清除率：

超氧阴离子自由基（O2-·）清除率/%=[（A0-AX）/A0]×100

1.3.7 总还原力的测定

参考罗敏等[12]的方法对黄瓜籽进行总还原能力的测定。取1 mL不同质量浓度的样品溶液（0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL）于试管中，加入 pH=6.6、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液2 mL与1%的铁氰化钾溶液2 mL，混匀50℃水浴20min，加入10%三氯乙酸2 mL混匀，并于5 000 r/min的条件下离心10min，取2 mL上清液，并依次加入2 mL蒸馏水与0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，反应10min后，以蒸馏水调零，在可见波长700 nm处测其吸光度值，平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 黄瓜籽总黄酮含量的测定

根据1.3.1的试验方法，制定芦丁标准曲线，如图1。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

得出的回归方程为Y=0.003 3X-0.007 1，相关系数R2=0.9992，线性关系显著，利用此线性方程并根据1.3.3的试验方法测得黄瓜籽总黄酮的含量为6.49 mg/g。

2.2 黄瓜籽清除DPPH自由基能力

常用DPPH自由基的清除活性来表示化合物的抗氧化能力，DPPH自由基的清除率较高，说明样品的抗氧化能力较强[13]。DPPH自由基本身呈紫色，经与抗氧化剂作用转变成黄色的稳定化合物，在517 nm处有较强的吸收，如有自由基清除剂存在的前提下，DPPH自由基的单电子被分配，从而导致其颜色变浅，在最大吸收检测波长处的吸光度值变小，利用比色法能够很好的判断自由基的清除情况[14-15]。黄瓜籽黄酮清除DPPH自由基能力见图2。

图2 黄瓜籽黄酮清除DPPH自由基能力Fig.2 The DPPH free radical scavenging ability of total flavnoids in cucumber seed

黄瓜籽黄酮有明显的清除DPPH自由基的能力，在质量浓度1.0 mg/mL时阳性对照VC的清除能力为93.65%，黄瓜籽黄酮的清除能力为73.25%，说明黄瓜籽黄酮有一定的清除DPPH自由基能力，但是弱于阳性对照VC。

2.3 黄瓜籽清除超氧阴离子自由基能力

黄瓜籽黄酮清除超氧阴离子自由基能力见图3。

图3 黄瓜籽黄酮清除超氧阴离子自由基能力Fig.3 The Superoxide anion radical scavenging activity of total flavnoids in cucumber seed

黄瓜籽黄酮有明显的清除超氧阴离子自由基的能力，在质量浓度1.0 mg/mL时阳性对照VC的清除能力为96.84%，黄瓜籽黄酮的清除能力为72.06%，说明黄瓜籽黄酮有一定的清除超氧阴离子自由基能力，但是弱于阳性对照VC。机体内有一定数量的超氧阴离子自由基存在，它由体内自身的氧化酶产生的，既不会发生化学变化也不会对机体造成危害。在有金属离子的催化作用下发生Fenton反应，生成具有较高活性的羟基自由基，其产物会使细胞中DNA产生损坏，引起蛋白质及脂质的氧化性损伤，进而导致机体功能的破坏，因此，样品对超氧阴离子自由基清除能力常常被用作反映其抗氧化活性高低的指标[16-18]。本次试验证明了黄瓜籽黄酮的体外抗氧化能力。

2.4 黄瓜籽黄酮清除羟自由基能力

研究表明[19-20]，羟自由基具有较强的氧化性，被认为是机体脂质过氧化反应的启动者，植物活性物质对羟自由基的清除能力直接和它的抗氧化活性相关。黄瓜籽黄酮和阳性对照VC对羟自由基的清除能力如图4所示。

图4 黄瓜籽黄酮清除羟自由基能力Fig.4 The hydroxyl radical scavenging ability of total flavnoids in cucumber seed

在0～1.0 mg/mL测定的浓度范围内，黄瓜籽黄酮与阳性对照VC对羟自由基的清除率随着浓度的增加而增大，当浓度达到1.0 mg/mL时阳性对照VC清除率可达 96.91%，黄瓜籽黄酮的清除率为71.63%，相较于阳性对照VC来说，黄瓜籽黄酮对羟自由基的清除能力较弱。

2.5 黄瓜籽黄酮总还原能力

总还原能力的强弱是用吸光度值的大小来衡量的，吸光度值越大表示其还原能力越强，它是用来评价化合物潜在抗氧化能力的指标。还原能力较强的物质，能够提供更多的电子，其供应的电子能够参与自由基反应将其变为稳定物质[21－22]。黄瓜籽黄酮与阳性对照VC的总还原能力如图5所示。

图5 黄瓜籽黄酮总还原能力Fig.5 The total reduction capacity of total flavnoids in cucumber seed

在测定的浓度范围内，随着黄瓜籽黄酮浓度的增加还原能力逐渐增强，当浓度达到1.0 mg/mL时，阳性对照VC吸光度值为0.794，黄瓜籽黄酮的吸光度值为0.514，黄瓜籽黄酮的总还原能力弱于阳性对照VC。

3 结论

本试验是以黄瓜籽为研究对象，以芦丁作为标准，并采用分光光度法测定黄瓜籽中总黄酮的含量，通过黄瓜籽黄酮对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟清除自由基及总还原能力的测定来评价其抗氧化能力。研究发现，在测定的浓度范围内，黄瓜籽黄酮能够对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基有较强的清除作用，并随着浓度的增加，总还原能力逐渐加强，表明黄瓜籽黄酮有较强的抗氧化活性。但由于本试验中黄瓜籽黄酮提取物为粗提物，会对试验结果有一定的影响。因此，在初步了解黄瓜籽总黄酮抗氧化活性的基础上，对粗体物进行分离纯化，筛选出有效活性的单体，进行更系统深入的研究提供方向。

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