定量分析癌胚抗原的谐振式无线生物传感器*

黎颖茵， 孙 浩， 左兆瑞， 毛红菊， 钱大宏

0 引 言

癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)浓度可以作为良性与恶性肿瘤的鉴别依据[1～5]。临床上常用的检测手段中[6～8]，酶联免疫吸附法检测灵敏度低，而其他方法虽然检测灵敏度高，但需要特殊的仪器设备，成本高，难以对临床样本进行快速、简便、低廉的检测。无线传感技术具有成本低、便于批量化制备、操作简便等优点，在通信、半导体、机械等领域已经得到广泛应用，但在生物检测方面的应用国内鲜有报道[9～12]。

本文提出了一种新型的谐振式无源无线生物传感器，根据不同浓度的CEA抗原改变叉指电极的电容值引起带宽值发生变化，通过电感线圈互感耦合的方式读取传感器信号，实现快速检测CEA抗原的浓度，从而为良性与恶性肿瘤的判断提供简便的检查方式，实现即时检验的功能。

1 实 验

1.1 试剂和耗材

CEA，癌胚抗原的特异性抗体(anti-CEA)，癌胚抗原量子点抗体(anti-CEA二抗)均购自上海领潮生物科技有限公司。(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES)、戊二醛(glutaraldehyde,GLU)和光敏苯并环丁烯(benzocyclobutene，BCB)购自Sigma公司。10 mmol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(pH值为7.2±0.1)购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。食人鱼(piranha)溶液为浓硫酸(H2SO4)和30 %过氧化氢(H2O2)的混合物(体积比7︰3)。在实验中，所购买的化学试剂和化学用品均可直接使用，无需纯化。所有的溶液配制均采用18 MΩ的MilliQ净化系统制备的超纯水。

1.2 谐振式无线传感器制备工艺

无线传感器包含叉指电极和电感线圈2个部分，制作工艺流程为：

1)清洗石英片:将石英片浸没在浓硫酸和双氧水的混合溶液中(两者比例约为10︰1)加热清洗直到溶液中的气泡消失，再依次放入到丙酮/乙醇/去离子水中分别进行超声清洗，用干燥洁净的氮气吹干。

2)匀胶光刻:在石英片表面旋涂光刻胶，通过曝光与显影在衬底表面光刻出金属电极的图形。

3)金属蒸发:通过电子束蒸发在衬底表面沉积10 nm厚的钛膜和200 nm厚的金膜。

4)金属剥离:将轮廓以外的金属剥离，完成金属电极和电感的初步制作。

5)再一次光刻，涂覆BCB，厚度为6 μm，显影后280 ℃固化3 h。

6)为了桥接电感和电极，重复步骤(2)～步骤(5)，在两者之间制作第二层金属,得到无线传感电极基底。

1.3 无线生物传感器的修饰制备

无线生物传感器的制备通过表面化学修饰的方法完成，具体修饰过程为：

1)清洗电极基底：为了去除电极表面存在的有机物，将电极依次浸泡在丙酮、无水乙醇、piranha溶液和氢氧化钠溶液中，最后用去离子水冲洗干净，在空气中晾干。

2)硅烷化处理：在将生物分子固定于相邻电极之间的间隙里之前，电极间隙需进行硅烷化处理。将洁净干燥的电极进行等离子体(Plasma)处理；将电极基底浸入含4 % APTES的无水乙醇溶液中；用无水乙醇清洗，120 ℃加热固定。

3)活化处理：将经过硅烷化处理的电极基底在戊二醛的水溶液中活化1 h后，用去离子水冲洗干净。

4)交联抗体：在电极表面加入0.1 mg/mL鼠抗人Anti-CEA抗体溶液，于37 ℃孵育2 h，使抗体分子通过戊二醛的交联作用固定在电极间隙;在牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)溶液中封闭1 h;固定好抗体的电极用去离子水清洗干净后在4 ℃保存备用。

5)孵育抗原:配制所需浓度的抗原溶液，加入到已经固定好抗体的电极上，于37 ℃孵育2 h，用PBS冲洗未结合的抗原;氮气吹干，准备电学测试。

1.4 肿瘤标志物的电学检测

电极上制备的单层电容电感(LC)谐振电路与读取器构成无线信号读取单元。读取设备由连接两匝线圈天线的矢量网络分析仪组成。传感器系统电容电感值的变化转换为谐振点频率特性(即带宽)的变化。频率范围设置为10 MHz～1 GHz，每次测试重复3次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 无线生物传感器的检测原理

利用普通光学显微镜观察叉指电极的结构，无源无线生物传感器主要由单层电感线圈L和叉指电容器C串联组成，外部读出系统主要由矢量网络分析仪和测试线圈组成，如图1(a)所示。测量时，将生物传感器靠近测试线圈，矢量网络分析仪输出交流信号施加在测试线圈上，通过与生物传感器上的LC谐振回路的电感线圈L互感耦合完成传递能量和信号。电极表面结合的癌胚抗原改变了传感器的参数，使传感器的复阻抗发生变化，从而改变传感器的带宽值。因此，传感器带宽的变化可以用于表征与传感器结合的癌胚抗原的浓度，实现癌胚抗原的无线无源检测。

该无线传感器的等效电路图如图1(b)所示。其中L2为传感器线圈的电感量，R2为线圈的电阻值。C2为叉指电极的电容值，RC为叉指电极的介质损耗电阻值。L1为测试线圈的电感量，R1为测试线圈的电阻值。生物传感器的谐振频率f的表达式为

(1)

图1 无线生物传感器的测量过程

传感器谐振回路的带宽(bandwidth,B)通过在不同的驱动频率下测量复阻抗变化得到，而带宽的变化能够反映传感器系统结合的癌胚抗原的浓度。观察无线生物传感器的阻抗谱，可知复阻抗最大值对应的频率为传感器的谐振频率，通过计算-3 dB处的频率范围可以得到传感器的带宽为

(2)

2.2 修饰方法的表征结果

传感器电极表面经过硅烷化、活化处理之后，加入量子点Anti-CEA抗体(一抗)，观察其是否能够牢固连接到电极表面。在荧光显微镜下电极间隙出现分布均匀明亮的绿色荧光条带，验证了Anti-CEA抗体能够均匀修饰到传感器电极表面。另外，电极经活化处理，并在孵育Anti-CEA一抗和CEA抗原之后，再加入量子点Anti-CEA(二抗)鉴定CEA抗原的特异性，观察CEA抗原抗体特异性结合的情况。荧光显微镜下可以看到免疫反应区域出现均匀明显的红色荧光条带，验证了与Anti-CEA一抗结合的是CEA抗原，排除了非特异性结合的干扰。上述结果表明：在该传感器电极表面不仅Anti-CEA抗体能够连接到电极表面，且CEA抗原能够和固定在电极上的Anti-CEA抗体特异性结合。证明电极上进行的抗原抗体特异性结合免疫反应有效可行。

2.3 肿瘤标志物的检测效果

将空载电极连接到矢量网络分析仪进行扫频测试，得到空载状态的带宽值。在传感器修饰制备过程中，加入戊二醛、Anti-CEA一抗、10 ng/mL CEA抗原溶液后分别进行扫频测试，观察传感器系统谐振时带宽的变化。如图2所示，在电极上修饰不同物质，所对应的带宽值变化显著。随着电极表面修饰的生物化学物质越多，带宽值变化越大。也就是说，传感器表面状态的细微变化就能引起传感器系统电容值的变化，使得谐振点的频率特性也随之改变。因此，该传感器能够灵敏地检测出不同的修饰状态，能够检测出传感器系统细微的变化，具有良好的灵敏度。

图2 实验过程的带宽值变化

配制浓度梯度为1,10,100,1 000 ng/mL的CEA抗原溶液，与固定在电极上的Anti-CEA抗体进行特异性结合反应后传感器系统的响应如图3所示。

图3 带宽值随不同浓度CEA抗原的响应变化曲线

可见，随着CEA抗原浓度的增加，带宽值也不断增大，且存在很强的相关性，线性拟合得到相应的回归方程为带宽值B=4.526 67×106×lg(CEA抗原浓度)+7 433 333.35，相关系数R2=0.994 59。该传感器有较广的适用浓度检测范围，初步检测到CEA抗原浓度范围为1～1 000 ng/mL，最低检测浓度为1 ng/mL，具有良好的适用性。

3 结束语

本文提出了一种基于互感耦合无线检测的叉指电极生物传感器。通过微机电系统技术制备得到该传感器的叉指电容和耦合线圈结构，利用戊二醛交联共价修饰方法在传感器电极表面连接上Anti-CEA抗体，通过抗原抗体特异性结合的免疫反应，实现了对CEA抗原的特异性和高灵敏检测。该传感器可以为肿瘤标志物的即时检验提供依据和可行性。

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