绍兴腐乳发酵过程中酶活力和化学组分变化探究

◎ 谢小本

（绍兴咸亨食品股份有限公司，浙江 绍兴 312000）

在目前我国腐乳生产所应用到的菌种中，绍兴腐乳的发酵菌种总状毛霉品质优良，在腐乳的发酵中十分重要。腐乳是我国民间传统的美食，其制作流程为让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。发酵过程看似简单，但从生物化学的角度而言，腐乳的发酵非常复杂，其中包含了多种酶系的共同作用。在豆腐接种蛋白酶活力很强的根霉或毛霉菌的菌种，其中蛋白质分解成为氨基酸以及其他物质，另外蛋白酶和附着在菌皮上的细菌慢慢渗透豆腐坯内部，分解蛋白质，再经过时间沉淀最后形成腐乳。腐乳制作成功的关键就是菌种的选择，总状毛霉借助良好的抗杂菌能力以及优良的发酵性能在目前我国腐乳发酵中的应用十分广泛[1]。为了解腐乳发酵成熟指标、缩短生产周期、提高腐乳品质，本次研究重点分析腐乳在生产过程中的酶活力变化以及组分变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

总状毛霉XH-22，绍兴咸亨食品股份有限公司选育的生产用菌种。

1.2 实验试剂、仪器

试剂：酪氨酸、果胶、福林酚试剂、三氯乙酸、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、麦芽糖、蛋白胨、脂肪酸、硫酸镁和酵母膏。

仪器：HH.B11420-BS型电热恒温培养、828型酸度计、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、超净工作台、生物显微镜。

1.3 培养基

黄泔水培养基：黄豆粉30 g、蔗糖3 g、硫酸镁2 g、磷酸二氢钾2 g、淀粉4 g补黄泔水至1 000 mL，113℃灭菌30 min。

1.4 实验方法

1.4.1 腐乳坯的制备

将实验所需的豆腐切块并摆好，使用高压喷壶接种一定比例的总状毛霉混合孢子悬液，每3块豆腐接种1 mL混合孢子悬液，将其置于霉菌培养箱中，调节培养箱的温度与湿度制得腐乳坯。

1.4.2 腐乳发酵菌液制备

利用6%接种量，将种子培养菌液接种于已经准备好的黄泔水培养基中，温度控制在28℃，200 r/min振荡培养48 h。

1.5 观察指标与测定方法

1.5.1 观察指标

对酶活力、腐乳前发酵酶活力、腐乳后发酵酶活力、腐乳后发酵化学组分变化进行测定分析。

1.5.2 测定方法

腐乳后发酵化学组分变化：①卤汤成分以及含量为绍兴酒86%、盐7%、香料1%、味精5%、辣椒面1%。②氯化钠含量的测定，参照SB/T10170-1993。③粗蛋白的测定，参照GB/T5009.5-2003。④脂肪测定，参照GB/T5009.6-2003。⑤游离脂肪酸的测定，参照GB/T15684-1995。⑥总酸的测定，参照GB/T5009.40-2003。⑦氨基酸态氮的测定，参照SB/T10170-1993。⑧还原糖含量的测定，参照SB/T10213-1994。

1.6 生产工艺

1.6.1 前期培菌

豆腐坯→接种（XH-22）→培养→凉花→搓毛。

1.6.2 后期发酵

腌坯（食盐）→裹辅料→装瓶（卤汤）→封口→后发酵。

2 结果与分析

2.1 总状毛霉XH-22培养

2.1.1 蛋白酶活力变化

通过分析发现，在发酵房培养条件下，XH-22发酵到30h是菌体产蛋白酶的高峰期，之后活力开始减弱。

2.1.2 粗蛋白的测定

通过研究发现，在18～30 h阶段粗蛋白含量下降非常快，30 h菌丝生物量达到高峰值。出现这种情况的原因可能是菌体在生长过程中直接利用培养液中的小分子氮源。

2.2 腐乳发酵酶活力变化

2.2.1 腐乳前发酵

通过分析发现，测定的酶系中，α-淀粉酶、脂肪酶活力在36 h达到最大值之后下降，蛋白酶、α-半乳糖苷酶、谷氨酰胺酶活力在48 h达到最大值随后下降，糖化酶在30 h、纤维素酶在66 h、果胶酶活力在72 h达到最大值，随后下降。通过分析发现，虽然不同酶在不同的时间达到最大值，但相同的是豆坯在培养36 h菌丝开始出现老化，如果继续培养其质量会出现明显的下降。综合各方面因素以及酶活力变化情况等结果，本次研究认为豆坯发酵培养最理想的时间是32～34 h。

2.2.2 腐乳后发酵

分析发现，本次研究的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纤维素酶、果胶酶发酵时间与酶活力成反比，只有谷氨酰胺酶发酵时间与酶活力成正比。随着实验的进行，发现当发酵至45 d，谷氨酰胺酶为86.3 U/g，基本形成了腐乳的风味，该结果可以作为判断腐乳成熟的一个参考指标。

2.3 腐乳后发酵过程中化学组分的变化

腐乳生产过程中化学组分变化情况见表1，①腐乳生产过程中，化学组分中的粗蛋白、粗脂肪以及还原糖的含量与发酵时间成反比，这种情况的出现可能与发酵过程中产生的蛋白酶、脂肪酶、糖化酶会将粗蛋白、脂肪、还原糖分解有关。②氨基态氮、游离脂肪酸和总酸的含量和发酵时间成正比。游离脂肪酸是脂肪水解后得到的产物，大豆蛋白质讲解的最终产物是游离氨基酸，而游离氨基酸含量的高低直接关系到腐乳鲜味。在腐乳发酵的过程中，由于腐乳前发酵阶段微生物分泌的脂肪酶会讲解豆坯中的粗脂肪，最终增加游离脂肪酸的含量。③腐乳的酸度是有机酸、游离氨基酸、脂肪酸共同作用的结果，特别是在发酵60 d后酸度出现明显性的一个增加，表明在发酵的后期有更多的酸性物质生成。④腐乳发酵过程中的盐分含量变化并不明显。

表1 腐乳生产过程中化学组分变化情况表

3 讨论

在豆腐的基础上通过利用微生物进行发酵得到的大豆制品腐乳，因具有良好的感官性能且营养丰富，不仅深受国内广大群众的喜欢，甚至已进入到其他国家的餐桌。以绍兴腐乳生产为例，2016年绍兴出口腐乳1 233 t，金额286.1万美元，数量和金额同比分别增长11.6%和11.3%，主要市场是中国香港地区，其次是东南亚、北美及欧盟。

面对不断增加的市场需求，实现腐乳的工业化生产成为满足其市场需求的主要方式。目前，工业生产腐乳主要采用的菌种为毛霉菌属和根霉菌属。不同地区的腐乳在口感、感官性质等方面都有一定差异，这与采用不同菌属以及微生物在发酵过程中产生的不同酶有较大关联。腐乳的生产过程实际上是一系列的生化变化——蛋白酶将豆腐中的蛋白质分解成多肽、氨基酸等小分子化合物。目前，食品研究相关报道显示，28 ℃、200 r/min摇瓶条件下雅致放射毛霉在黄豆粉为原料的培养基中生长良好。正常情况下，在前期培菌的过程中，菌丝体会大量积累，到36～40 h逐渐稳定。目前对总状毛霉并没有相关的研究报道，本次研究重点分析腐乳发酵过程中酶活力以及化学组分的变化情况，通过分析发现与，虽然摇瓶发酵与发酵房发酵的最佳培养时间不同，但通过对蛋白酶活力、粗蛋白的测定可以发现，发酵30 h与摇瓶发酵36 h生长情况是一致的。出现这种结果的原因可能是发酵的转速以及溶氧量较大，通过采用扩大培养的方式能够将发酵周期的时间提前，进一步可以认为通过对总状毛霉的深层培养可以取代现有的腐乳生产方式，进而达到发酵周期短、菌种纯度高、生产效率提高的效果。

另外，为确保腐乳风味以及感官效果，可以考虑采用多种酶系协同发酵的方式，本次研究通过利用XH-22对酶活力进行测定发现XH-22在豆坯上发酵的最佳时间是32～34 h。考虑从化学组分角度进行分析发现，通过对腐乳前期培养、后期发酵过程中进行酶活力以及化学组分的变化分析，发现谷氨酰胺酶≥86.3 U/g、总酸≤1.3%、游离氨基态氮≥0.35%、还原糖≤1.1%及黏度≤2×105mPa·s时可以作为判断腐乳成熟的参考标准之一。

[1]解春芝，曾海英，宋 杰，等.不同种类腐乳游离脂肪酸组成分析及营养评价[J].中国酿造，2018（2）：39-44.

[2]袁华伟，易小妹，杨粟平，等.汤料成分对白方腐乳保质的影响[J].食品研究与开发，2018，39（5）：100-106.

[3]喻世哲，范 熠，韩北忠，等.低盐腐乳生产过程及加工环境中的微生物分析[J].中国酿造，2017，36（12）：18-22.

[4]盛明健，周华林，邢利民，等.玫瑰腐乳发酵用红曲菌种的筛选和应用研究[J].江苏调味副食品，2017（4）：19-23.

[5]程教擘，谢艳华，刘 金，等.传统发酵豆制品生产过程中的安全隐患及改进措施[J].食品安全质量检测学报，2017，8（8）：3092-3098.