伪狂犬病PCR检测方法的建立

王皓婷 ，纪爱英，程 龙★，张彦昌 ，袁 英，孙 岐 ，赵素杏，陈清亮

(1.河北省邯郸市动物疫病预防控制中心，河北 邯郸 056000；2.河北省邯郸市饲料工业办公室，河北 邯郸 056000)

本病是一种可侵害多系统的急性传染病，由伪狂犬病病毒引起。由于净化难度较大，给养猪业带来巨大损失。能够快速区分野毒和疫苗株对伪狂犬病净化有着十分重要的意义。PCR检测方法与ELISA检测方法相较，有准确、快速、易于操作等优点。本方法可以区分野毒感染与被动免疫，经优化各项反应条件后，测得本试验最低检测模板量为3.75pg/μL，敏感性较高，目的条带长度为597bp。

1 材料

1.1 参考序列

Gen Bank数据库中伪狂犬病病毒标准毒株序列。

1.2 病毒DNA

本研究中所使用的伪狂犬病病毒标准毒DNA由河北工程大学兽医实验室惠赠。

1.3 试剂

Taq DNA 聚合酶、dNTPs（2.5mM）、10×PCR buffer、琼脂糖、DL2000 DNA Marker等均购自大连宝生物工程公司，设计好的引物委托大连宝生物工程有限公司合成。

1.4 主要仪器

台式离心机MiniSpin Eppendorf;移液器Eppendorf/大龙医疗设备(上海)有限公司;PCR仪GeneAmp 9700Life Technologies(AB&Invitrogen);电泳仪DYY-8C凝胶成像系统/北京六一生物科技有限公司

1.5 病料采集

从邯郸市各县区选取猪场采集病料共计200份。所采猪只均出现有呼吸道症状、发热等异常情况。病料种类有肺脏，延髓，脾脏，肾脏和淋巴结等，对所采集病料按场点分类、编号。

2 方法

2.1 设计引物

伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗因免疫效果较好而得到广泛使用。是否包含gE基因是野毒株与疫苗株最大的区别。本试验针对伪狂犬病毒gE基因设计引物，扩增产物片段为597bp。

PRV：（PRV1）5’-ACACACCGGGGTTGAG-3’

（PRV2）5’-TGCAGCGTGTAGAGGC-3’

2.2 病毒DNA的提取

运用世纪元亨猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒中的DNA提取柱按说明书步骤提取病毒DNA。

2.3 PCR反应体系的构建

以伪狂犬病病毒标准毒DNA作为反应模板，构建扩增体系，总体积为 25μL：（1）PRV DNA 2μL；（2）上下游引物各 0.8μL；2×GC buffe 12.5μL；Taq DNA 聚合酶 0.5μL；dNTPs（2.5mM）3μL；灭菌双蒸水 5.4μL。

反应程序为：94℃预变性 5min；循环：94℃变性45s，52℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1min，共 35 个循环；72℃延伸10min。取10μLPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。

2.4 反应条件的优化

对退火温度和引物的加入量进行摸索，以确定上述PCR体系的最佳反应条件。表1为PRV PCR反应体系的各项摸索内容。

2.5 敏感性试验

用紫外分光光度计测定提取出的PRV DNA的浓度并记录。随后取5μLDNA进行10倍梯度稀释，直至稀释到10-6。从稀释度为 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液中各取 2 μL作为模板，在其它反应条件相同的情况下分别进行扩增。扩增产物各取10μL，同时进行1%琼脂糖凝胶电泳，对比结果，检测本方法的敏感性。

2.6 特异性试验

待所有条件均摸索好、确定最佳反应体系后，分别以PRV的 DNA、双蒸水、CSF的 cDNA、PCV2的 DNA、PRRSV的cDNA、JEV的cDNA为模板，同时进行扩增，用以验证本方法的特异性。

2.7 阳性检出率试验

表1 PRV PCR反应条件优化

用本试验建立的PCR方法对收集的病料进行检测并记录阳性率，再使用世纪元亨猪伪狂犬病病毒PCR检测试剂盒进行检测，比较两种检测方法的符合率。

3 结果

3.1 PRV PCR方法建立的结果

将PRV标准毒的DNA做为模板，运用本试验建立的PCR方法进行扩增，所得条带大小在500bp～750bp之间（见图1）。测序鉴定无误，目的条带为597bp，与预期结果相符。

图1 PRV PCR扩增结果

3.2 PRV PCR反应条件的优化结果

3.2.1 确定最适退火温度

在各种选定的退火温度下都能扩增出特异性条带，但在53℃时，扩增出的条带相比其他温度最亮（图2），因此将最适退火温度定为53℃。

图2 PRV PCR退火温度优化结果

3.2.2 确定最佳引物量

加入引物（10μmol/L）量为0.7 μL时，出现的特异性条带最亮（图3），扩增效果最好，但其它浓度亦可扩增出目的条带。

图3 PRV PCR引物量优化结果

3.3 敏感性试验结果

经紫外分光光度计侧得PRV的DNA模板的起始浓度为 37.5ng/μL，结果如图 4 所示，稀释度为 10-2、10-3、10-4、10-5时均可扩增出特异性条带。经计算得知，最低检测量为3.75pg/μL。

图4 PRV PCR敏感性试验结果

3.4 特异性试验结果

分别以双蒸水、PRV的 DNA、CSF的 cDNA、PRRSV的cDNA、PCV2的DNA、JEV的cDNA为模板，进行PCR扩增的结果如图5所示，仅有PRV的DNA扩增出了特异性条带，说明本试验特异性较好。

图5 PRV PCR特异性测定结果

3.5 阳性符合率检测结果

分别使用世纪元亨试剂盒和本试验建立的建立的检测方法对200份样品进行了检测，其中世纪元亨的检出数为78份，本试验建立的检测方法的检出数为76份，说明本试验建立的PCR检测方法与世纪元亨的检测结果有较高的阳性符合率。

4 讨论

4.1 本试验为伪狂犬病病毒PCR检测方法的基础摸索性试验，后续可考虑加入野毒株与疫苗株都具备的基因，如gB基因、gD基因等其他基因片段，与gE基因同时扩增。双基因的扩增可很好的避免假阴性结果的出现。

4.2 可进一步探究伪狂犬病病毒基因与其它猪DNA病毒（如猪瘟等）基因一同扩增，建立多重PCR检测方法，同时检测多种病种，提高检测效率。